[发明专利]一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法及底物序列和应用

权利要求书

1.一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.在细胞中过表达ADAR蛋白，再交联蛋白质和RNA；

S2.裂解细胞，免疫共沉淀蛋白与RNA交联复合体，消化未被蛋白保护的RNA，用TSAP酶对消化后的RNA进行去磷酸化处理，接着用T4 PNK对RNA的5’末端做磷酸化修饰，进行RNA分子间连接，然后对连接后的RNA末端加接头，纯化120 kb～200 kb大小范围的蛋白及RNA复合体并提取RNA后进行逆转录反应得cDNA；

S3.以步骤S2获得的cDNA为模板做环化反应，纯化后再线性化并进行两轮PCR扩增，第二轮PCR时在扩增产物两端分别接上测序文库3'接头和5'接头，对构建好的文库进行高通量测序；

S4.将高通量测序获取的序列信息去接头、质控、基因组对比，将读长比对到转录组，丢弃比对上的读长，保留未比对上的读长并记录为U1；把U1读长比对到基因组并丢弃连续比对上的读长，保留未比对上的读长并记录为U2；把U2读长比对到基因组，把唯一且不连续的比对上的读长记录为嵌合体读长并记录为U3；把U3读长比对到基因组上，并且根据比对结果对U3进行重新组合；把重组之后的读长比对到基因组上，并提取嵌合体读长；再对上述结果进行整合，获得完整的嵌合体读长集；再以嵌合体两条臂读长为中心取交集后再分别与非嵌合体读长取交集，重组后的双臂读长再进行结构预测截取出双链RNA底物序列，分别以左臂L和右臂R为标记注释其序列信息组装出ADAR蛋白的作用底物序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1为在细胞中过表达携带外源蛋白标签的ADAR蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白标签为3×FLAG标签。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述交联为紫外交联。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述消化为利用RNA酶进行消化。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述接头为iR800染料标记的接头。

7.由权利要求1～6任一所述方法获得的ADAR蛋白高效结合的底物，其特征在于，所述底物为双链RNA底物，由左臂和右臂组成，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示。

8.权利要求1～6任一所述方法或权利要求7所述的ADAR蛋白高效结合的底物在非疾病诊断治疗目的的定点靶向RNA编辑或在制备定点靶向RNA编辑产品中的应用。

9.权利要求1～6任一所述方法或权利要求7所述的ADAR蛋白高效结合的底物在制备RNA基因治疗药物中的应用。