[发明专利]一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法及底物序列和应用

说明书

本发明公开了一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法及底物序列和应用。所述方法包括如下步骤：S1.细胞准备及蛋白与RNA交联反应；S2.免疫共沉淀及双链RNA消化，连接，和逆转录；S3.cDNA环化、建库和高通量测序；S4.ADAR底物拼装；S5.高效结合底物的评估。本发明首次开发了一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法irCLASH，本发明从实验及生物信息学的角度填补现有ADAR1结合底物研究存在的空缺，与现有其他研究蛋白与RNA相互作用的方法相比，可显著提高嵌合体读长的得率，可最大限度提高了ADAR蛋白作用底物的构建数量，同时缩短实验耗时、简化了实验操作。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地，涉及蛋白质与RNA互作技术领域，更具体地，涉及一种获取、定位ADAR蛋白在细胞内高效结合的底物序列信息的方法及底物序列，以用于定点靶向RNA编辑。

背景技术

基因突变是许多疾病及癌症发生的关键诱因，目前已经有3000多个基因特定位点的突变与疾病的发生有关联，随着二代测序技术发展，不论是遗传获得性的基因突变还是后天生长发育过程中某些体细胞的基因突变都可以通过二代测序技术获得突变位点信息，并且通过关联分析找到与疾病发生直接相关的突变位点。但目前各种肿瘤在不同的人群中会有不同的突变位点及突变类型，这样开发不同的靶向药物具有一定的难度，而基因疗法可直接对基因的突变位点进行修复。 CRISPR(Clustered regμLarly interspaced short palindromicrepeats)最早发现于细菌免疫系统中，结合cas蛋白抵抗外源病毒的入侵。目前CRISPR/Cas技术已经广泛应用到生物医学及农业学研究中。CRISPR/Cas技术可以在真核细胞基因组水平引入正确编码的全长基因拷贝，也可以沉默产生突变的基因的表达、对突变位点进行定点修复。在2014年已经有第一例报道成功利用CRISPR技术对地中海贫血症进行临床治疗。地中海贫血症由HBB基因突变引起的血红蛋白水平降低造成。该研究团队将患者皮肤成纤维细胞诱导分化成多能干细胞并用 CRISPR/Cas9技术修复突变位点，并将修复后的干细胞诱导成红细胞前体细胞并重新移植到患者体内达到治疗目的。但CRISPR/Cas系统也有其不可避免的缺点，该系统需要同时表达Cas蛋白及导向RNA(gRNA)及提供同源修复DNA序列，且在多篇研究报道中都检测出其在DNA水平或RNA水平有明显的脱靶效应， CRISPR/Cas蛋白切割基因组DNA造成DSB(double-strand break)，脱靶会造成基因组的不稳定性以及不可预测的细胞命运。此外，CRISPR/Cas系统还可能会引发细胞固有免疫反应，例如，金黄色葡萄球菌来源的Cas9蛋白会诱导血液中的T细胞产生炎症反应进而引起组织坏死。CRISPR/Cas系统的严重缺陷造成其临床应用的局限性，故开发更加安全有效的基因疗法是目前具有巨大临床价值的研究。