[发明专利]橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)的专用引物及其快速分子检测方法与应用。本发明鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)的专用引物，是由序列1和序列2组成的引物对。本发明为分子快速检测方法，该方法对样本中含有的DNA进行PCR反应，当PCR产物呈现416bp特异性产物时，即样本为暹罗炭疽(Colletotrichum siamense)病原菌。该方法操作简单，特异性强，可检测真菌DNA的含量最低为10pg。

技术领域

本发明属于橡胶树炭疽病的病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测橡胶树叶片携带暹罗炭疽菌的方法及引物。

背景技术

天然橡胶是世界四大工业原料之一，我国是世界上最大的天然橡胶消费国，虽然也是生产国家之一，但远远不能满足国内的需求。如何保证天然橡胶生产的稳定和提高，是当前亟待解决的问题。

由炭疽属真菌(Colletotrichum spp.)引起的炭疽病(Colletotrichum leafdisease，CLD)是威胁天然橡胶产业的重要病害。该病在橡胶树的各个生理期均能发生，主要为害橡胶树叶片，引起橡胶树反复落叶、树冠稀疏，影响幼苗和幼树生长，降低开割树产胶量。该病在叶片上表现出多种症状，包括成熟叶片上的典型炭疽症状、纸质状病斑、圆锥状凸起病斑以及嫩叶上的皱缩病斑。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)在过去被认为是该病害的病原菌，直到1994年尖孢炭疽菌在橡胶树上被首次报道。由于炭疽菌的重要性，其分类问题一直是菌物学家研究的热点。近年来，分子生物学技术在真菌分类鉴定中的应用，对炭疽菌属的分类鉴定方法产生了深刻影响，属下分类单元也不断增加。按最新的分类方法，炭疽属包括14个复合种。目前在橡胶树上报道的与引起炭疽病相关的复合种包括胶孢炭疽复合种、尖孢炭疽复合种和博宁炭疽复合种，其中胶孢炭疽复合种中的暹罗炭疽菌(Coletotrichum siamense)和尖孢炭疽复合种中华南炭疽(C.australisinense)为优势种。由于引起该病害的病原菌种类多，有些症状易与白粉病等其它的病害症状混淆。因此，给该病害的准确鉴定带来了一定的困难。对病原菌进行准确鉴定，进而对病害进行快速的早期诊断，具有重要实际应用价值。

目前，只是建立了橡胶树炭疽病胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种的特异引物和PCR检测方法，还没有复合种内特定种的特异引物和PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一对暹罗炭疽菌的特异引物,以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的橡胶树炭疽病分子检测方法。

本发明的研究人员对大量的基因进行了序列分析，最终根据ApMat序列(ApMat是位于Apn2和MAT1-2-1基因之间的基因间隔区)设计了一对橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽的特异性检测引物，并建立了等位基因特异性PCR(allelespecific PCR，AS-PCR)检测方法，实现高效准确的对橡胶树炭疽病病原菌的分子检测。

本发明提供的鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)的专用引物，是由序列1和序列2组成的引物对。

本发明的鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(Coletotrichum siamense)的方法是通过以下方式实现的：

对橡胶树炭疽病发病叶片进行取样，提取样品基因组DNA作为模板，以上游引物CSAMPF：5’-AGTCGTGACAGCGGCTGTGT-3’(序列表中序列1)