[发明专利]用于检测黄热病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物

说明书

本发明公开了一种用于检测黄热病毒的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物和应用，属于生物技术检测领域。提供的RT‑LAMP引物能够实现对黄热病毒的特异性检测，提供的RT‑LAMP试剂盒的检测操作简单、特异性强、灵敏度高，可以快速且高效对黄热病毒进行检测，可以用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测黄热病毒。

技术领域

本发明属于生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于检测黄热病毒的RT-LAMP检测专用引物和检测试剂盒，及该检测试剂盒在检测黄热病毒中的应用。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus)是黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。病毒经蚊虫传播，传播媒介主要为埃及伊蚊，目前主要在非洲及南美洲流行。人群对黄热病毒较为易感，病死率可达20％-40％，是国际三大检疫传染病之一。虽然目前我国未见有黄热病的大规模流行，但我国某些地区的地理条件和气候条件与黄热病高发区域相似，也存在发病的可能性。在过去的20多年里，黄热病感染者逐年增加，据世界卫生组织(WHO)估计，每年至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，严重威胁到人们的健康。目前，随着全球经济的不断发展，国际间人群交往频繁，黄热病病例输入非黄热病流行地区的风险日益增加，因此在检疫口岸，快速检测黄热病毒可将外来感染阻挡于国门之外，因此建立黄热病毒的快速、灵敏检测方法对预防和控制黄热病毒疫情的传播和流行具有重要意义。

根据WHO文件及卫生部印发的《6种输入性传染病预防控制指南和临床诊疗方案》，黄热病实验室诊断主要有血清学检测、核酸检测以及病毒分离。血清学检测灵敏度和特异性不如核酸检测高，在一些基层单位无法满足检测需要；病毒分离对环境要求高、周期长且影响因素多，不适宜在基层实验室开展；核酸检测主要有PT-PCR及Real-time RT-PCR，但需要特殊仪器，一些设备条件相对简陋的基层单位无法进行。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于检测黄热病毒的RT-LAMP引物组，包括序列表中SEQ ID NO:14所示的引物F3、SEQ ID NO:15所示的引物B3、SEQ ID NO:16所示的引物FIP和SEQ ID NO:17所示的引物BIP。

本发明另一方面提供一种用于检测黄热病毒的RT-LAMP试剂盒，包含上述的RT-LAMP引物组。

上述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2-8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24-36pmol。

上述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol。

上述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol Reaction Buffer、100mM MgSO₄、5mM betaine、10mM dNTP，Bst DNApolymerase和WarmStart RTx reverse transcriptase。

上述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×Thermopol ReactionBuffer2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNApolymerase 1μl，WarmStart RTx reverse transcriptase 0.5μl。

上述RT-LAMP试剂盒还包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含黄热病毒基因组RNA，所述阴性对照为不含黄热病毒基因组RNA的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。