[发明专利]巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途在审
| 申请号： | 202010161853.9 | 申请日： | 2020-03-10 |
| 公开（公告）号： | CN111454885A | 公开（公告）日： | 2020-07-28 |
| 发明（设计）人： | 褚茂平;郭晓令 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学附属第二医院;温州医科大学附属育英儿童医院 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077;C12N5/074;C12N7/01 |
| 代理公司： | 温州名创知识产权代理有限公司 33258 | 代理人： | 陈加利 |
| 地址： | 325000 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 综合症 诱导 多功能 干细胞 及其 制备 方法 分化 培养基 用途 | ||
1.一种巴氏综合症可诱导多功能干细胞制备方法，其特征在于包括以下步骤：：
S1:取巴氏综合症患者的150-200毫升尿液，通过离心方式分离获取尿液细胞；
S2:细胞计数后以3.5-4×105数量接种到基质胶37℃孵育1个小时以上的6孔培养板中，传代后培养第三代尿液细胞达到80％汇合，采用EDTA胰蛋白酶进行消化传代；
S3:将经步骤S2培养的尿液细胞感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种转录因子的仙台病毒进行重编程诱导，病毒感染15天后开始出现克隆团细胞；
S4:挑选出扩增培养的克隆团细胞，并将其转移到新的基质胶孵育过的24孔培养板上培养，用仅第一天含有10微摩尔Y-27623的E8培养基按每天换液方式继续培养，5-7天后克隆团达到90％汇合；
S5:采用0.5毫摩尔EDTA消化后按1：6-1：10的比率进行传代培养，通过多次传代，从而获得纯化的巴氏综合症患者尿液细胞来源的可诱导多功能干细胞的细胞系。
2.一种巴氏综合症可诱导多功能干细胞制备所用的重编程诱导的病毒，其特征在于：该病毒为感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种转录因子的仙台病毒。
3.一种如权利要求1所述制备方法所制备的巴氏综合症可诱导多功能干细胞。
4.一种基于权利要求3所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞在分化培养心肌细胞的应用，其特征在于：将所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞在培养基培养后进行多个阶段分化，获得心肌细胞。
5.根据权利要求2所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞在分化培养心肌细胞的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)将所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞接种到基质胶孵育，然后通过E8培养基按每天换液方式进行培养2-3天；
(2)分化第一个阶段，培养基换为含5微摩尔CHIR99021的RPMI+B27-Insulin分化培养基处理2天；
(3)分化第二个阶段，培养基换为含5微摩尔IWR-1的RPMI+B27-Insulin分化培养基处理2天；
(4)分化第三个阶段，培养基换为普通RPMI+B27-Insulin分化培养基处理2天；
(5)分化第四个阶段，培养基换为普通RPMI+B27+Insulin分化培养基持续培养，然后每两天换液一次。
6.一种如权利要求3所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞分化培养心肌细胞所用的分化培养基，其特征在于该分化培养基包括有：
用于分化第一阶段的含5微摩尔CHIR99021的RPMI+B27-Insulin分化培养基；
用于分化第二个阶段的含5微摩尔IWR-1的RPMI+B27-Insulin分化培养基；
用于分化第三个阶段的RPMI+B27-Insulin分化培养基；
以及用于分化第四阶段的RPMI+B27+Insulin分化培养基。
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