[发明专利]巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途

说明书

本发明公开了巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途，取巴氏综合症患者的150‑200毫升尿液，通过2000转/分钟离心10分钟获取尿液细胞。细胞计数后以3.5‑4×10⁵数量接种到基质胶37℃孵育1个小时以上的6孔培养板中。传代后培养第三代尿液细胞达到80％汇合后，感染含OCT4、SOX2、KLF4和c‑MYC四种转录因子的仙台病毒进行重编程诱导。病毒感染15天后开始出现克隆团样细胞，通过手工挑选克隆团细胞转移到新的基质胶孵育过的24孔培养板上培养。通过多次传代，完成多项指标鉴定后，从而获得纯化的巴氏综合症患者尿液细胞来源的iPS细胞系(TAZ‑UiPSC)。该TAZ‑UiPSC可以被定向诱导分化为心肌细胞来建立体外细胞模型，用于巴氏综合症发病机理的研究和靶向药物的筛选。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体是指巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途。

背景技术

在1983年,巴斯综合征(BTHS)被彼得·巴斯博士首次发现，并被广泛认为是一种罕见的与X染色体连锁的常染色体隐性遗传病。该病包含骨骼肌病，心肌病，生长迟缓和3-甲基戊烯二酸尿症等，发病率仅为1/300000-400000。巴斯综合征的临床特征包括肥厚型心肌病、扩张型心肌病、左室不致密、室性心律失常、心内膜纤维弹性变性、近端肌病、心源性猝死、中性粒细胞减少、嗜睡和疲劳、低血糖、乳酸中毒、进食困难等。

在1996年，巴斯综合征的潜在突变被定位到Xq28染色体上的tafazzin(TAZ)基因上，主要包括TAZ基因的删除突变(c.517delG)和错义突变(c.328TC)。TAZ基因主要参与心肌细胞中心磷脂(CL)的生物合成，该过程主要分布于线粒体膜中，心肌细胞中心磷脂(CL)可与呼吸链、线粒体代谢物载体、塑造线粒体形态蛋白等多种重要蛋白复合物直接相互作用发挥功能。

由于人的心肌细胞很难获取，难度大成本高。

发明内容

为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途，从而获得可诱导多功能干细胞的更多来源和更多应用价值。

为实现上述目的，本发明的第一个目的是提供一种巴氏综合症可诱导多功能干细胞制备方法，包括以下步骤：

S1:取巴氏综合症患者的150-200毫升尿液，通过离心方式分离获取尿液细胞；

S2:细胞计数后以3.5-4×10⁵数量接种到基质胶37℃孵育1个小时以上的6孔培养板中，传代后培养第三代尿液细胞达到80％汇合，采用EDTA胰蛋白酶进行消化传代；

S3:将经步骤S2培养的尿液细胞感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种转录因子的仙台病毒进行重编程诱导，病毒感染15天后开始出现克隆团细胞；

S4:挑选出扩增培养的克隆团细胞，并将其转移到新的基质胶孵育过的24孔培养板上培养，用仅第一天含有10微摩尔Y-27623的E8培养基按每天换液方式继续培养，5-7天后克隆团达到90％汇合；

S5:采用0.5毫摩尔EDTA消化后按1：6-1：10的比率进行传代培养，通过多次传代，从而获得纯化的巴氏综合症患者尿液细胞来源的可诱导多功能干细胞的细胞系。

本发明的第二个目的是还提供一种巴氏综合症可诱导多功能干细胞制备所用的重编程诱导的病毒，该病毒为感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种转录因子的仙台病毒。

本发明的第三个目的是一种如巴氏综合症可诱导多功能干细胞，记为TAZ-UiPSC。

本发明的第四个目的是提供一种基于所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞在分化培养心肌细胞的应用，将所述的巴氏综合症可诱导多功能干细胞在培养基培养后进行多个阶段分化，获得心肌细胞。