[发明专利]一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统

权利要求书

1. 一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，其特征在于，包括：

（1）包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因，所述重组表达载体为pSB2μ，GLuc报告基因的基因序列如SEQ ID No.1所示；

（2）包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，N基因的基因序列如SEQ ID No.2所示，辅助质粒使用的载体为pRK5质粒，

所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1，

其中，（1）中包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体的制备方法为：

（1.1）全长感染性克隆目的片段的扩增：

以ZJU/G2/2013株全基因组cDNA为模板，使用5对引物，扩增得到相应的5个基因组全长片段，其中，扩增片段名称和所用引物为：

（a）扩增片段PEDV-G2-ZJU-F1所用引物

上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-F：

5’-GAGCTCGTTTAGTGAACCGTACTTAAAAAGATTTTCTATC-3’，

下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-R：

5’-CTTATAAGAATAGAACGGTTTGACAACAGGCTCCAATA-3’；

（b）扩增片段PEDV-G2-ZJU-F2所用引物

上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F2-F：

5’-TGTATTGGAGCCTGTTGTCAAACCG-3’，

下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F2-R：

5’-ACAACACCTAGGAAAACATTACCAG-3’；

（c）扩增片段PEDV-G2-ZJU-F3所用引物

上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F3-F：

5’-ACTTCTCCATTTCATCTGGTAATGT-3’，

下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F3-R：

5’-TTGACCACCTAGGATTTTTAGCCAA-3’；

（d）扩增片段PEDV-G2-ZJU-F4所用引物

上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F4-F：

5’-GATGTTGTGCGTATGTTTTTGGCTA-3’，

下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F4-R：

5’-ACACAGAAAGAACTAAACCCATTGA-3’；

（e）扩增片段PEDV-G2-ZJU-F5所用引物

上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-F：

5’-ATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTG-3’，

下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-R：

5’-TTTTTTTTGTGTATCCATATCAACACCGTCAGGTCTTCAG-3’；

将ORF3基因替换为GLuc报告基因，扩增GLuc片段并将所述PEDV-G2-ZJU-F5片段扩增为两个片段PEDV-G2-ZJU-F5a和PEDV-G2-ZJU-F5b；为了保证PEDV-G2-ZJU-F5a片段的3’端与GLuc片段5’端、PEDV-G2-ZJU-F5b片段5’端与GLuc片段3’端至少有20bp的同源区，以便于重叠PCR；将PEDV-G2-ZJU-F5a、PEDV-G2-ZJU-F5b和GLuc片段利用重叠PCR方法融合，最后获得重组F5片段PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5，引物序列如下：

PEDV-G2-ZJU-F5a上游引物PEDV-G2-ZJU-F5a-F：

5’-ATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTG-3’，

PEDV-G2-ZJU-F5a下游引物PEDV-G2-ZJU-F5a-R：

5’-GCAAACAGAACTTTGACTCCCATCACTGCACGTGGACCTT-3’，

PEDV-G2-ZJU-F5b上游引物PEDV-G2-ZJU-F5b-F：

5’-CAAGGGGGCCGGTGGTGACTGACTCAATTCAACTAGACGAG-3’，

PEDV-G2-ZJU-F5b下游引物PEDV-G2-ZJU-F5b-R：

5’-TTTTTTTTGTGTATCCATATCAACACCGTCAGGTCTTCAG-3’，

GLuc上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F：

5’-TTGAAAAGGTCCACGTGCAGTGATGGGAGTCAAAGTTCTG-3’，

GLuc下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-R：

5’-ATACTCGTCTAGTTGAATTGAGTCAGTCACCACCGGCCCC-3’；

将PEDV-G2-ZJU-GLuc全长各片段连接进载体上，PEDV-G2-ZJU-F1片段的5’端与载体片段3’端、PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5片段3’端与载体片段5‘端’至少有20bp的同源区，以便于同源重组，引物序列如下：

PEDV-G2-ZJU-F1上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-F：

5’-GAGCTCGTTTAGTGAACCGTACTTAAAAAGATTTTCTATC-3’，

PEDV-G2-ZJU-F1下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-R：

5’-CTTATAAGAATAGAACGGTTTGACAACAGGCTCCAATA-3’，

PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-F：

5’-ATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTG-3’，

PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-R：

5’-TTTTTTTTGTGTATCCATATCAACACCGTCAGGTCTTCAG-3’，

（1.2）全长感染性克隆的拼接

将PEDV-G2-ZJU-GLuc各个DNA片段及线性化的pSB2μ载体通过体外同源重组的方式连接成全长感染性克隆重组质粒, 命名为pSB-PEDV-G2-ZJUGluc，即为所述包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体。