[发明专利]一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统

说明书

本发明公开了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，包括：包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因；包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1。本发明构建的感染性克隆带有GLuc报告基因，拯救的重组病毒在感染动物和细胞时会产生分泌型Gaussia荧光素酶，非常易于检测，在病毒毒力分析等实验研究方面有很强的应用价值。同时，由于ORF3区被替换为GLuc报告基因，本系统拯救的重组病毒可制成新型标记疫苗，通过检测猪血清中是否有Gaussia荧光素酶，快速区别疫苗株免疫和野毒株感染，实用价值很高。

技术领域

本发明涉及冠状病毒反向遗传技术领域，特别是涉及一种基于DNA质粒转染的拯救猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的反向遗传系统。

背景技术

猪流行性腹泻是猪的一种急性、高度接触性的肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)所引起。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和食欲下降为基本特征。各年龄猪均易感，但以新生仔猪最为严重，其发病率和死亡率可达90％-100％。该病首先发现于欧洲，现广泛流行于包括中国、韩国、菲律宾等在内的许多亚洲国家，已成为严重危害养猪业的主要传染病之一。目前，亚洲、美洲流行的PEDV主要是G2基因亚型毒株，占比90％以上，对全球养猪业造成了巨大的威胁。

PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28kb，含有7个开放阅读框(Open reading fram,ORF)，包括负责编码多聚蛋白的ORF1a和ORF1b，编码辅助蛋白的ORF3和编码四种结构蛋白的S基因(纤突糖蛋白)、E基因(小分子膜蛋白)、M基因(膜蛋白)、N基因(核衣壳蛋白)。

反向遗传学技术是通过构建RNA病毒的感染性全长cDNA克隆，在DNA分子水平上对其进行体外操作，从而研究病毒结构与功能的方法。但目前，仍然存在一些问题阻碍冠状病毒全长感染性cDNA克隆的构建，例如冠状病毒的基因组很大(27-32kb)、常规技术很难操作、一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性、在体外得到的转录本具有异质性等。

如公开号为CN 107267532A的发明专利申请公开了一种PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用。该发明利用酶切连接获得病毒基因组全长cDNA，通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA，再电转化入Vero细胞进行病毒拯救。但该方法酶切位点选取限制较多，而且体外将多个大片段进行酶切连接效率较低，难以适用于其他毒株全长感染性克隆的构建。此外利用添加的T7启动子，进行体外转录获得的转录本具有异质性，病毒拯救效率较低。

PEDV ZJU/G2/2013株是本实验室于2013年分离的浙江强毒株，该毒株通过细胞传代适应之后可在Vero细胞上稳定增殖并产生细胞病变。对ZJU/G2/2013株进行全基因组测序，并与其他PEDV毒株的全基因序列及S基因序列比对分析遗传进化关系，表明PEDV ZJU/G2/2013株属于当前流行的G2基因亚型。现有技术中，缺乏用于研究PEDV ZJU/G2/2013株致病机制的全长感染性cDNA和有效疫苗。

现有技术制备的疫苗在使用过程中，特别是在区分疫苗株免疫与野毒株感染时，检测鉴定比较困难，工作量大、耗费时间长。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，建立了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDVZJU/G2/2013株的反向遗传系统，克服了现有技术中冠状病毒部分复制酶基因cDNA克隆在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统的酶切连接效率较低的问题，也克服了体外转录导致的转录本异质性的问题。