[发明专利]一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法有效
申请号: | 202010162844.1 | 申请日: | 2020-03-10 |
公开(公告)号: | CN111218527B | 公开(公告)日: | 2023-08-22 |
发明(设计)人: | 姬宏超;万艳娟;胡东雄;阳享元 | 申请(专利权)人: | 广州赛百纯生物科技有限公司 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6806 |
代理公司: | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人: | 颜希文 |
地址: | 510000 广东省广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 环境 样本 非洲 猪瘟 病毒 检测 试剂盒 方法 | ||
1.一种非疾病诊断目的的采用试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法,其特征在于,所述试剂盒包括特异性引物AP72-F和AP72-R,以及TaqMan探针AP72-P;所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM,3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1;其中特异性引物和TaqMan探针序列如下:
AP72-F:5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’;SEQ ID NO:1;
AP72-R:5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’;SEQ ID NO:2;
AP72-P:5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1;SEQ ID NO:3;
所述试剂盒还包括环境样本DNA提取纯化试剂、扩增反应液、阳性对照和阴性对照;
所述环境样本DNA提取纯化试剂包括裂解液、裂解增强剂、去抑制剂因子、结合液、漂洗液、洗液、磁珠液、二氧化锆珠、洗脱液;
所述裂解液包括181mM Na2HPO4和121mM GuHCl;所述裂解增强剂包括0.5M SDS、10mMTris和20mM EDTA;所述去抑制剂因子为133mM Al3+;所述结合液包括5MGuHCl和体积浓度为10%Isopropanol;所述漂洗液为3M GuSCN;所述洗液为50mM Tris,pH为6.6;所述磁珠液中磁珠粒径为1nm,磁珠液的浓度为50mg/ml;所述二氧化锆珠的直径为1mm;所述洗脱液为10mM Tris,pH为8.5;
所述方法包括如下步骤:
(1)待测样本DNA的提取;
提取步骤包括:(a)环境样本处理:所述环境样本取自养猪环境中的猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食槽及食槽下方的食物残渣、猪唾液、擦拭环境的抹布、拭子、猪尿液、养殖用水中的至少一种;
所述环境样本处理的具体操作如下:
猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食槽及食槽下方的食物残渣或猪唾液的处理:取小于0.25g猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食槽及食槽下方的食物残渣或250μl猪唾液加入研磨管中,加入750~900μl S1-Lysis Buffer涡旋、混匀;
擦拭环境的抹布或拭子的处理:取擦拭环境的抹布或拭子置于15ml或50ml离心管中,加入1ml PBS缓冲溶液浸泡后,用镊子挤压抹布或拭子,取250μl液体至研磨管中,加入750μl S1-Lysis Buffer涡旋、混匀;
猪尿液或养殖用水的处理:使用负压设备,配合抽滤装置抽滤50ml~200mL的猪尿液或养殖用水,将抽滤装置中的滤膜取出,用剪刀剪碎放入研磨管中,加入750μl S1-LysisBuffer涡旋彻底、混匀;
所述S1-Lysis Buffer为裂解液;
(b)将60μl S2-Lysis Enhancer溶液加入至步骤(a)处理后的样品中,65℃孵育10min,涡旋震荡10min,然后12000rpm离心5min,取400μl上清至1.5ml的离心管中;所述S2-LysisEnhancer为裂解增强剂;
(c)往步骤(b)所述的1.5ml的离心管中加入250μl S3-Cleanup Buffer,混匀,12000rpm离心2min,取上清液转移至结合液中,将预封装试剂板放入到核酸提取仪中,插入磁棒套,然后编辑核酸自动提取仪,并启动运行,待程序运行25min结束后,将洗脱孔的核酸转移至另一离心管中,进行定量PCR检测;所述S3-Cleanup Buffer为清除液;所述预封装试剂板中孔位试剂分布及试剂体积如下表所示,所述试剂体积的单位为μl;
(2)PCR扩增:反应体系设为25μl,在多个PCR反应管内加入非洲猪瘟病毒扩增反应液20μl,将步骤(1)提取的待测样本DNA5μl、阳性对照5μl、阴性对照5μl分别加入不同的PCR反应管中,混匀离心进行PCR反应;所述PCR扩增的反应程序为:预变性95℃10min,1个循环;95℃15s,55℃30s,40个循环;55℃结束时采集Fam荧光信号;
(3)PCR扩增产物的检测结果与判定:通过检测通道的Ct值进行结果判定。
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