[发明专利]一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明提供一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，包括特异性引物AP72‑F(SEQ ID NO：1)和AP72‑R(SEQ ID NO：2)，以及TaqMan探针AP72‑P(SEQ ID NO：3)；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ‑1。本发明提供的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，可广泛用于检测养殖环境中多种环境样本，打破了单个环境样本检测的局限性，其检测方法灵敏度达10copise/μl，所述环境样本非洲猪瘟病毒的检测与多种病毒无交叉反应，可广泛适用于非洲猪瘟恢复养殖的实时监控。

技术领域

本发明涉及一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

非洲猪瘟病毒防控一直是各国重点防控的疫病，无论是已成功根除非洲猪瘟的西班牙、巴西等国或仍在与非洲猪瘟斗争的俄罗斯，历史经验都证明根除非洲猪瘟需要耗费大量人力、物力，非洲猪瘟不仅对养猪业造成重创，兽药和饲料行业也受到不小影响。我国生猪产业链影响因素错综复杂，面对非洲猪瘟疫情，除了提升诊断水平和积极研发疫苗提供技术支持，还应找到各个防控环节实际关键点，推动产业一体化转型升级。

常规的猪瘟检测主要是以猪的血清、血浆、抗凝血、口腔黏液以及肺、淋巴结、肾脏、骨髓和扁桃体组织中进行抽样，都是从猪的本身来检测，起不到未雨绸缪的作用；非洲猪瘟恢复养殖过程中，首先要确定的是养殖环境是否安全，是否在消毒后，非洲猪瘟病毒被完全消除。如果养殖之前，养殖环境仍残留非洲猪瘟病毒，通过虫媒传播，会给养殖户及整个产业链再次带来沉重打击。养殖的环境样本基本上包括：猪舍、养殖用水、食槽及食槽下面的食物残渣、土壤(猪场附近3公里内)、猪的粪便、猪尿液、猪唾液以及运送饲料、生猪的车辆、参与养殖的人员穿戴、猪舍内的灰尘、蜘蛛网等。不但要对这些部位进行清理、消毒，还要对消毒后的这些部位进行荧光定量检测，确保环境中无非洲猪瘟的存在，这样才能为非洲猪瘟恢复养殖保驾护航。

申请号为201910534130.6的中国专利，公开了将蚯蚓投放在猪舍周边或生产污区或病死猪处理位置或猪场进出入口的土壤中培养，之后再检测蚯蚓进行粉碎，使用荧光定量PCR检测，确定是否有非洲猪瘟的存在。该方法只能适合消毒后的土壤检测，而对于其他环境样本(养殖用水、食槽内、食槽下面、猪舍内蜘蛛网、运输生猪车辆等)具有局限性。申请号为201910853261.0的中国专利，公开了使用免提取的方法只能对已经病变的猪或者濒危的病猪进行检测，无法满足非洲猪瘟恢复养殖的现实需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，包括特异性引物AP72-F和AP72-R，以及TaqMan探针AP72-P；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和TaqMan探针序列如下：

AP72-F：5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’；SEQ ID NO：1；

AP72-R：5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’；SEQ ID NO：2；

AP72-P：5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1；SEQ ID NO：3。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述检测试剂盒还包括：环境样本DNA提取纯化试剂、扩增反应液、阳性对照和阴性对照。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述环境样本DNA提取纯化试剂包括裂解液、裂解增强剂、去抑制剂因子、结合液、漂洗液、洗液、磁珠液、二氧化锆珠、洗脱液。