[发明专利]一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法

说明书

本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒的分离鉴定方法，属于病毒检测领域。本发明的方法是将病毒样品经终浓度6‑12μg/ml的胰酶孵育10‑20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4‑6天后，检测HA效价；HA试验中，样品HA效价不低于4log2，则为阳性。本发明的方法可以方便、快速地检测出H9亚型禽流感病毒，且灵敏度高于传统的鸡胚检测法，应用前景良好。

技术领域

本发明属于病毒分离鉴定领域。

背景技术

禽流感病毒可引起的人和动物的感染，根据致病性强弱，将禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，其中H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，广泛存在于养殖场中，尽管各级农业部门和养禽企业采取了多种防治措施，但该病对养禽业仍造成了巨大的损失。禽流感分离鉴定能对环境中的禽流感病毒进行监控和预警，是防控禽流感疫情的重要手段。

禽流感分离鉴定包括分离和鉴定两部分。

鉴定的目的是对病原体进行病毒种类的识别。常见的鉴定方法包括血清学方法和分子生物学方法等。血清学方法包括血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、琼脂凝胶扩散(AGP)试验、神经氨酸酶抑制试验(NIT)、病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分子生物学方法包括PCR、逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、基因芯片、DNA测序等等。

而分离的目的是将病原体纯化和扩增，达到足以被准确鉴定的病原体含量水平。分离的效率直接关系到鉴定的准确性。常见的分离方法是将样品进行有限稀释(可省略)，再接种到SPF鸡胚或犬肾传代细胞(MDCK细胞)中进行培养。

SPF鸡胚是隔离养殖的、不带有禽类流行传染病病原的鸡所产的蛋，其费用较高；且鸡胚对有些血清型的病毒的敏感性不够，且分离出来的病毒抗原性变异比较大，容易产生假阴性。

MDCK细胞相对费用较低，但其对H9亚型禽流感的敏感性仍然有待提高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法。

本发明的技术方案包括：

一种H9亚型禽流感病毒分离方法，其特征在于，它包括：

将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天。

进一步的，所述培养环境温度为37摄氏度。

进一步的，所述培养环境中CO₂浓度为5％。

进一步的，所述培养的持续时间是5天。

一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法，它包括：

将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天后，进行HA试验；

HA试验中，样品HA效价不低于4log2，则为阳性。

如前述的方法，它还包括对病毒类型进行进一步验证，即：当HA试验中样品HA效价不低于4log2时，再将检测HA为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原进行HI试验；

所述HI试验使用的阳性血清包括H9亚型禽流感阳性血清和其他血清；

所述其他血清为：鸡新城疫、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感和产蛋下降综合征阳性血清中的一种或一种以上；

当H9亚新禽流感阳性血清HI效价不低于4log2，且其他血清HI效价低于4log2，则鉴定为H9亚型禽流感。