[发明专利]新型小动物体内微量细胞活体成像标记方法

说明书

本发明提供了一种新型小动物体内细胞活体成像的方法。它是使用组织特异性启动子控制CreER的表达，以外源他莫昔芬控制CreER的激活，以LoxP/CreER系统控制荧光素酶基因Akaluc的表达，构建一个多重“开关”控制下的Akaluc表达的转基因动物模型。该方法能够保证Akaluc稳定表达，并能在极低剂量荧光素Akalumine条件下，实现经济、高效的小动物活体成像和微量细胞的特异性谱系追踪。

技术领域

本发明属于动物活体成像技术领域。

背景技术

小动物活体成像技术是一种活体体内观察组织或细胞动态变化的成像技术，具有无干扰、持续观察的优点，广泛用于生命科学研究。目前，小动物成像技术目前主要是用于小鼠，但是不限于小鼠，对小动物的大小以及体重等没有特别的要求。小动物活体成像分为两种：一种是荧光发光成像，其成像时需要激发光激发发光基团产生荧光，进行成像；另一种是生物发光成像，生物发光是基于荧光素酶在Mg²⁺和荧光素的存在下，消耗ATP进行氧化反应，产生荧光进行成像，不需要激发光进行激发(如图1所示)。

活体生物发光成像中最常使用的荧光素酶是萤火虫荧光素酶Fluc，与荧光素D-luciferin反应产生发射光波长为560nm左右的荧光用于活体成像。 560nm波长的发射光生物组织穿透能力差、血脑屏障穿透性弱且灵敏度低，不能进行深层组织细胞、微量细胞甚至单细胞、脑部组织或需要高灵敏度的生物学过程的标记和观察，因而荧光酶Fluc主要用于表层组织细胞、高细胞数量的肿瘤异种移植等相关科学实验研究。

为了提高和改进活体生物发光成像技术的组织穿透性、信号灵敏度，扩大其应用范围，科研人员对荧光素进行了一系列的改进。Shiv.K等人为了观察异种移植的脑部胶质母细胞瘤的变化情况，化学合成出一种新的Fluc底物 CycLuc1，和D-luciferin相比，CycLuc1穿透血脑屏障的能力更强，适用于脑部肿瘤的观察。然而，其产生的发射光波长为604nm，组织穿透能力没有较大改进，灵敏度较差。

日本东京工业大学Takahiro Kuchimaru等人也对荧光素酶Fluc的反应底物进行了优化，化学合成出一种新的名为Akalumine的新型荧光素。和之前 Fluc反应底物相比，Akalumine反应产生的荧光波长为675nm左右，具有很好的生物组织穿透能力，为观察深层次组织或细胞的变化情况奠定了基础，但是荧光强度较差，影响活体成像的灵敏度。除改进荧光素外，科研人员对荧光素酶Fluc也进行了改善，以符合相应的研究需要。Promega公司开发出名为NanoLuc的荧光素酶，具有更小的分子量，和其底物Furimazine反应后产生更强的荧光信号，具有高灵敏度，适用于需要高灵敏度的复杂生物学研究应用。但是其发射光波长为465nm，组织穿透能力差，不适用深层次组织细胞的标记观察。

在Takahiro Kuchimaru等人研究成果基础上，日本脑科学研究中心的 Satoshi1wano等人对Fluc通过一系列的诱导突变筛选过程，找到更加适合 Akalumine底物的荧光素酶Akaluc。Akaluc和Akalumine反应产生的发射光波长为650nm左右，具有很好的组织穿透能力。更进一步，和Fluc与Akalumine 反应产生的荧光相比，Akaluc和Akalumine反应产生的荧光信号更强，灵敏度甚至达到了可用于少量细胞或单细胞体内观察水平。Akaluc和Akalumine生物发光反应组合达到了高组织穿透力、高灵敏度以及高血脑屏障穿透性等技术优势，能够显著扩大活体生物发光成像技术的应用范围。

Satoshi Iwano等人为了实现体内细胞活体成像，将Akaluc基因构建到腺相关病毒中，再将后者注射到小鼠海马区域，麻醉小鼠，腹腔注射底物 Akalumine，得到生物发光荧光信号(Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely movinganimals，Science 359(6378)，935-939.)。该方法的主要缺点是：