[发明专利]一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用

权利要求书

1.一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：将胚胎干细胞用EDTA在培养箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干细胞悬浮液，并将胚胎干细胞悬浮液中的胚胎干细胞分散成单个细胞，将分散后悬浮液离心；

S02：弃去步骤S01中离心后的液体的上清液，加入PBS重悬细胞，取PBS重悬细胞液离心；

S03：弃去步骤S02中离心后的液体的上清液，加入拟胚体培养液，再次重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，经离心后放入培养箱中培养，培养得到拟胚体；

S04：将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，分化得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S01中，消化时间为5分钟，加入PBS的体积为EDTA体积的2-5倍，使用移液器吹打胚胎干细胞悬浮液，使胚胎干细胞分散成单个细胞，然后将分散后悬浮液加入离心管中，300g离心3分钟。

3.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S02中，加入PBS重悬细胞后，取含有300-600万个细胞的PBS重悬细胞液于离心管中，300g离心3分钟。

4.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S03中，加入拟胚体培养液后用移液器重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，100g离心3分钟，然后放入培养箱中培养，将得到的拟胚体取出放入超低吸附多孔板中继续培养，之后每2天更换一次拟胚体培养液。

5.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述的培养箱为37℃二氧化碳培养箱。

6.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，拟胚体培养孔板预处理的步骤如下：往拟胚体培养孔板中每孔加入防粘冲洗液，1000g离心3分钟，然后弃掉防粘冲洗液，每孔加预热后的拟胚体培养液，吹吸后弃掉，然后每孔再加入拟胚体培养液，放入37℃二氧化碳培养箱备用。

7.根据权利要求6所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S03中，所述的拟胚体培养液含有DMEM、KSR、L-谷氨酰胺、NEAA、beta-巯基乙醇和Y-27632。

8.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S04中，将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，每两天换液一次；培养得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。

9.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括步骤S05，S05：当细胞培养皿内，细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养，之后的每次传代，当细胞汇合度达到80％以上时，再次传代。

10.一种采用如权利要求1-9任意一项所述一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法得到的人胚胎干细胞源性的间充质干细胞在治疗急性呼吸窘迫综合征中的应用。