[发明专利]一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用，属于生物技术领域。解决了现有分化得到的hESC‑MSCs纯度不高等问题。一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：将胚胎干细胞用EDTA在培养箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干细胞悬浮液，并将胚胎干细胞悬浮液中的胚胎干细胞分散成单个细胞，将分散后悬浮液离心；弃去步骤S01中离心后的液体的上清液，加入PBS重悬细胞，取PBS重悬细胞液离心；弃去步骤S02中离心后的液体的上清液，加入拟胚体培养液，再次重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，经离心后放入培养箱中培养，培养得到拟胚体；拟胚体在MSC分化培养基中贴壁培养10天后就可获得hESC‑MSC。本发明具有分化所需时间短，可快速获得hESC‑MSCs等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按照发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自囊胚期的内细胞团，具有无限增殖和三胚层分化潜能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是属于中胚层的一类多潜能干细胞，是最具代表性的成体干细胞之一，主要存在于结缔组织和器官间质中，如骨髓、脂肪、脐带、羊膜组织，间充质干细胞具有强大的增殖能力和免疫调节功能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞由于具备多向分化和免疫调节功能，因此在治疗一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有广阔的临床应用前景。国际干细胞协会对人MSCs的鉴定做了规定，要求满足以下几点。(1)MSCs在标准培养条件下能贴壁生长；(2)MSCs表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD14、CD34、HLA-DR、CD79a，其中CD105、CD73、CD90的阳性率应≥95％，其他阴性标志物的阳性率应≤2％；(3)MSCs在体外能向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。

MSCs可以从骨髓、脂肪组织、外周血和脐带血等不同的组织和器官里分离得到。从骨髓可以分离到较多的MSCs，但是需要通过做手术才能获得，脂肪组织、外周血和脐带血方便获得，但是分离出的MSCs数量偏少，同时也会受到供体疾病、体质、年龄的影响，质量不可靠，数量也有限。因此从这些组织和器官分离MSCs并不是高效的方式。将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)诱导分化为间充质干细胞(MSCs)，即人胚胎干细胞源性的间充质干细胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells,hESC-MSCs)。hESC-MSCs与成体MSCs具有相似的生物学特性和功能，来源丰富，不产生畸胎瘤，均一性好。hESC-MSCs结合了hESCs和成体MSCs的优点，为临床应用提供了充足的MSCs来源。

目前hESC-MSCs的诱导方法主要有三种：拟胚体诱导法、饲养层法及培养基直接诱导法。拟胚体诱导法是hESCs诱导分化的经典途径，通过拟胚体的形成启动分化过程，进而诱导获得MSCs。然而，由于拟胚体内部分化不均一，导致MSCs的纯化过程较长。饲养层法是将骨髓基质细胞系作为饲养层，诱导获得MSCs细胞，然而，在诱导过程中，由于诱导MSCs与基质细胞具有类似的形态，因此分化过程不易观察，获得的细胞需通过流式细胞进行分选纯化，增加了细胞的损失和实验步骤，且获得的细胞容易被动物源性成分污染，不利于hESC-MSCs的后期应用。培养基直接诱导法步骤简单，可避免由于饲养层细胞的使用导致的细胞污染问题。然而，该诱导方法中血清浓度较高，不能很好地抑制其他成纤维样细胞的分化，初始获得的MSCs纯度不高，需通过数次传代或流式分选进行纯化，延长了诱导时间(1-2个月)。因此，迫切需要能够制备安全的、稳定的、具有高诱导效率的hESC-MSCs的制备方法。