[发明专利]小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法

权利要求书

1.一种小鼠皮层中的8种氨基酸含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、标准品溶液的配制；

步骤二、小鼠皮层的取样；

步骤三、除皮层样品中的蛋白质；

步骤四、衍生试剂的配制和衍生化反应；

步骤五、HPLC-FLD分离测定皮层样品中的8种氨基酸；

步骤六、结果计算。

2.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤一中对标准品的配制具体方法为：

以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸为标准品，分别用超纯水配制成1.0mg/mL的储备液，备用。

3.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤二中的小鼠皮层的取样的具体方法为：

取小鼠断头处死，立即剪开头皮，除去硬脑膜和头盖骨，在冰皿上分离出大脑皮层，用生理盐水洗去残血，吸干水分，称重，在玻璃匀浆器中加入1:1(m/v)体积的去离子水进行匀浆，匀浆液置于-80℃冰箱内保存备用。

4.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤三中除去皮层中的蛋白质的具体方法为：

取步骤二中的皮层匀浆液，加入按1mg/μL的比例体积的内标β-氨基丁酸(600mg/mL)溶液，加入与皮层匀浆液体积比为1:5的乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀，10000×g，4℃离心10min，取上清液，用超纯水稀释20倍供HPLC-FLD测定。

5.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤四中衍生化试剂OPA的配制的具体方法为：

精密称取邻苯二甲醛(OPA)16.1mg于10mL的EP管内，加入0.4mL的甲醇溶解，再加入3.57mL的10mmol/L的硼酸钠缓冲溶液(用饱和NaOH溶液调pH至10.0)，加入30μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀，得浓度为4.0mg/mL的OPA溶液，于4℃避光保存备用。

步骤四中衍生化反应的具体方法为：

使用时取100μL标准品工作液或者样品溶液，加入50μL的OPA衍生化试剂，立即在室温下涡旋混匀30s，静置1min，进样20μL进行分析。

6.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤五中HPLC-FLD分离测定皮层样品中的8种氨基酸，测定条件如下：

检测器：Waters 2475型荧光检测器

色谱柱：依利特ODS(4.6×250mm，5μm)

流动相A：甲醇；

流动相B：乙酸钠水溶液，pH＝6.0

梯度洗脱程序为：0-7min：10％-40％A；7.01-9min：40％A；9.01-10min：40％-60％A；10.01-18min：60％A；18.01-19min：50％A；19.01-20min：70％A；

柱温：35℃；

流速：1.0mL/min；

检测波长：激发波长：340nm发射波长：450nm

进样量：20μL。

7.如权利要求1所述的小鼠皮层中的氨基酸含量的检测方法，其特征在于，步骤六中结果计算具体为：

按公式(1)计算天冬氨酸的含量；按公式(2)计算谷氨酸的含量；按公式(3)计算谷氨酰胺的含量；按公式(4)计算丝氨酸的含量；按公式(5)计算甘氨酸的含量；按公式(6)计算精氨酸的含量；按公式(7)计算牛磺酸的含量；按公式(8)计算γ-氨基丁酸的含量；

Y＝0.072X+0.0019 (1)

Y＝0.1356X+0.0001 (2)

Y＝0.3045X+0.0127 (3)

Y＝0.2231X+0.0127 (4)

Y＝0.3971X+0.0172 (5)

Y＝0.1985X-0.0032 (6)

Y＝0.3577X+0.0028 (7)

Y＝0.3077X-0.003 (8)

式中：

Y：待测物与内标物质的峰面积之比；

X：待测物的浓度，单位为微克每毫升。