[发明专利]小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法

说明书

本发明公开了一种测定小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法，包括以下几个步骤：步骤一、标准品的配制；步骤二、小鼠皮层的取样；步骤三、除皮层样品中的蛋白质；步骤四、衍生试剂的配制和衍生化反应；步骤五、HPLC‑FLD分离测定皮层样品中的8种氨基酸；步骤六、结果计算。本发明提供的小鼠皮层中8种氨基酸检测方法具有操作简便、结果准确度和灵敏度高的优点，可实现样品中8种氨基酸的快速检测。

技术领域

本发明涉及医药化学检测领域，更具体地说，本发明涉及一种小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法。

背景技术

氨基酸是构成生命体的重要基础物质，脑组织中的氨基酸类神经递质在中枢神经系统中参与调节生理活动，已有研究表明，脑内氨基酸水平的异常与脑部疾病的发生关系密切，如抑郁症、脑缺血、阿尔兹海默症等。天冬氨酸和谷氨酸属于中枢神经系统的兴奋性氨基酸，谷氨酸中枢神经系统中含量最多。它们能够调节脑部的发育，但过量会有神经毒性作用，损伤中枢神经系统。γ-氨基丁酸和甘氨酸属于中枢神经系统的抑制性氨基酸，γ-氨基丁酸由谷氨酸脱羧酶在神经末梢生成，对中枢神经系统起到抑制作用，调节脑内各种神经递质的水平，有抗焦虑的作用。甘氨酸通过作用NMDA受体，对脑缺血和空间记忆有双向调节作用；谷氨酰胺具有保护大脑，调节情绪，学习的作用。丝氨酸是合成嘌呤、嘧啶、胆碱的前体物质。精氨酸在脑中促进生长激素的合成。牛磺酸是含硫氨基的氨基酸，在脑内分布广泛，含量丰富，具有改善记忆，促进垂体激素分泌的作用。

目前，对氨基酸的测定常用方法有液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)，高效液相色谱法(HPLC)。尽管液相色谱-质谱法灵敏度高、特异性好，但其设备价格昂贵而不能广泛使用。通过优化色谱条件、预处理条件，衍生方法来提高高效液相色谱的灵敏度与准确度。本实验以β-氨基丁酸为内标物质，OPA为衍生试剂，采用柱前衍生的方法建立一种灵敏度高、分离效能高、操作简便的测定小鼠皮层中氨基酸的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种小鼠皮层中氨基酸含量的检测方法。

为了实现根据本发明的这些目的，提供了一种测定小鼠皮层中8种氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、标准品的配制；

步骤二、小鼠皮层取样；

步骤三、除皮层样品中的蛋白质；

步骤四、衍生试剂的配制和衍生化反应；

步骤五、HPLC-FLD分离测定皮层样品中的8种氨基酸；

步骤六、结果计算。

优选的是，步骤一中对标准品的配制的具体方法为：

以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸为标准品，分别用超纯水配制成1.0mg/mL的储备液，备用。

优选的是，步骤二中小鼠皮层取样的具体方法为：

取小鼠断头处死，立即剪开头皮，除去硬脑膜和头盖骨，在冰皿上分离出大脑皮层，用生理盐水洗去残血，吸干水分，称重，在玻璃匀浆器中加入1:1(m/v)体积的去离子水进行匀浆，匀浆液置于-80℃冰箱内保存备用。

优选的是，步骤三中除皮层中的蛋白质的具体方法为：

取步骤二中的皮层匀浆液，加入按1mg/μL的比例体积的内标物β-氨基丁酸(600mg/mL)溶液，加入与皮层匀浆液体积比为1:5的乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，10000×g，4℃离心10min，取上清液，用超纯水稀释20倍供HPLC-FLD测定。

优选的是，步骤四中衍生试剂OPA的配制的具体方法为：