[发明专利]一种降低棉花转基因材料泛菌的方法

权利要求书

1.一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)培育无菌苗，取无菌苗下胚轴切段外植体；

(2)制备浸染液；

(3)使用步骤(2)制备的浸染液侵染步骤(1)所述的外植体，吸干菌液后放入共培养培养基进行共培养；

(4)对步骤(3)共培养后的外植体进行诱导筛选培养，获得愈伤组织；

(5)使用增殖培养基对步骤(4)诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养，至愈伤组织分化，形成胚性愈伤组织；

(6)将步骤(5)获得的胚性愈伤组织转入第一分化培养基进行透气培养，10-15d继代一次，连续继代3-5次直至出现胚状体；

(7)将步骤(6)形成的胚状体转入第二分化培养基，继续继代培养，直至形成小植株；

(8)将步骤(7)形成的小植株转入成苗培养基中，继代培养，形成转化再生株。

2.根据权利要求1所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述制备浸染液的具体步骤如下：将培养至对数生长期的农杆菌菌液用LB稀释100倍，加入50mg/L的乙酰丁香酮，在温度为26-28℃，转速为180-200rpm/min的条件下振荡培养0.5～1.0小时，备用。

3.根据权利要求2所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤如下：使用步骤(2)制备的浸染液浸染步骤(1)所述的外植体5-10min，将浸染后的外植体吸干菌液放入共培养培养基，21℃暗培养48h。

4.根据权利要求3所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，所述共培养培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel 2.8-3.0g/L，0.1mg/L 2,4-D，0.1mg/L KT，pH 6.8。

5.根据权利要求4所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，步骤(4)的具体步骤如下：

①将步骤(3)共培养后的外植体放入第一筛选培养基中，先暗培养1个月，再光暗交替培养1个月，共培养2个月；获得愈伤组织；

②将直径1-2cm的愈伤组织转入第二筛选培养基中二次筛选光暗交替培养1个月；小于1cm的愈伤组织再次转入第一筛选培养基中二次诱导筛选光暗交替培养1个月。

6.根据权利要求5所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel 2.8-3.0g/L，2,4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，卡那霉素100mg/L，头孢霉素600mg/L，pH 6.8；

所述第二筛选培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel 2.8-3.0g/L，卡那霉素100mg/L，头孢霉素600mg/L，pH 6.8。

7.根据权利要求6所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，步骤(5)所述增殖培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel 2.8-3.0g/L，pH 6.8。

8.根据权利要求7所述的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，其特征在于，步骤(6)所述第一分化培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12mg/L，葡萄糖27g/L，Phytagel 3.5g/L，天冬素0.45-0.55g/L，谷氨酰胺0.8-1.2g/L，pH 6.8；其中，改良MS培养基中不含有硝酸铵。