[发明专利]一种降低棉花转基因材料泛菌的方法

说明书

本发明公开了一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，属于组织培养技术领域。本发明公开的一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，通过采取对浸染液的稀释、浸染后吸干外植体上的菌液、低温共培养、严格继代操作规范、避光保存筛选培养基、避光诱导筛选1个月等技术可使外植体及愈伤的泛菌现象降低到5％以下，棉花抗性愈伤组织频率提高到65％以上。

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，更具体的说是涉及一种降低棉花转基因材料泛菌的方法。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，然而其种植过程中容易遭受严重病虫害，进而使得每年皮棉产量损失达总产的10％-20％。

随着生物工程技术的发展，研究人员将许多有益的农艺性状、抗病虫和抗逆等性状转化到棉花中，以提高其产量和品质，增加抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗逆性，从而提高棉花的种植效率，降低成本，并减轻环境污染。农杆菌介导转化法可以高效地将外源基因整合到棉花基因组中，而外源基因的稳定遗传和高效表达必须以组织培养为基础。农杆菌介导的棉花转基因体系经浸染转化的外植体在诱导筛选过程中以及撤掉抗菌素的增殖培养过程中常常出现泛菌现象，有时甚至因转化材料泛菌严重而全部废弃要重新转化，费工费时给棉花转基因造成很大的麻烦和浪费，影响棉花转化进程和转化率的提高。

因此，提供一种降低棉花转基因材料泛菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，提高棉花转化效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种降低棉花转基因材料泛菌的方法，具体步骤如下：

(1)培育无菌苗，取无菌苗下胚轴切段作为外植体；

(2)制备浸染液；

(3)使用步骤(2)制备的浸染液侵染步骤(1)所述的外植体，吸干菌液后放入共培养培养基进行共培养；

(4)对步骤(3)共培养后的外植体进行诱导筛选培养，获得愈伤组织；

(5)使用增殖培养基对步骤(4)诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养，至愈伤组织分化，形成胚性愈伤组织；

(6)将步骤(5)获得的胚性愈伤组织转入第一分化培养基进行透气培养，10-15d继代一次，连续继代3-5次直至出现胚状体；

(7)将步骤(6)形成的胚状体转入第二分化培养基，继续继代培养，直至形成小植株；

(8)将步骤(7)形成的小植株转入成苗培养基中，继代培养，形成转化再生株。

进一步，步骤(2)所述制备浸染液的具体步骤如下：将培养至对数生长期的农杆菌菌液用LB稀释100倍，加入50mg/L的乙酰丁香酮(AS)，在温度为26-28℃，转速为180-200rpm/min的条件下振荡培养0.5～1.0小时，备用。

进一步，步骤(3)的具体步骤如下：使用步骤(2)制备的浸染液浸染步骤(1)所述的外植体5-10min，将浸染后的外植体吸干菌液放入共培养培养基，21℃暗培养48h。

进一步，所述共培养培养基以改良MS培养基为基础，还包括如下组分：维生素B₁8-12 mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel 2.8-3.0g/L，0.1mg/L 2,4-D，0.1mg/L KT(kinetin)，pH 6.8。

进一步，步骤(4)的具体步骤如下：

①将步骤(3)共培养后的外植体放入第一筛选培养基中，先暗培养1个月，再光暗交替(12h光照，12h黑暗)培养1个月，共培养2个月；获得愈伤组织；