[发明专利]牙间充质干细胞培养基及在牙髓干细胞内的活性验证方法

权利要求书

1.一种牙间充质干细胞培养基，其特征在于，该培养基以a-MEM为基础培养基，添加包括表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、维生素C、TGF-β受体抑制剂LY3200882、γ-secretase抑制剂LY411575和DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC在内的生长因子和小分子抑制剂的组合物，形成牙间充质干细胞培养基；其中组合物中各个成分的量为：表皮细胞生长因子的含量为10-200μg/L；血小板衍生生长因子的含量为100-500μg/L；维生素C的含量为10-100mg/L；TGF-β受体抑制剂LY3200882的含量为100-500nM；γ-secretase抑制剂LY411575的含量为50-200nM；DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC的含量为1-20nM。

2.一种如权利要求1所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细胞的预处理，

分离培养原代牙髓干细胞，分为原代细胞对照组、常规培养基长期培养组和牙间充质干细胞培养基长期培养组；其中，原代细胞对照组为原代的牙髓干细胞，长期培养组为牙髓干细胞在常规培养基和牙间充质干细胞培养基中传代至第9代；

(2)细胞体外生物学性能的评价，

2.1细胞的形态及表面标志物的评价；

2.2细胞增殖和衰老的评价；

2.3干细胞特性的评价；

2.4细胞迁移能力的评价；

2.5牙髓干细胞成牙分化能力的评价；

(3)动物体内牙髓再生能力的评价，

将2.1中得到的牙髓干细胞复合胶原后注入制备好的牙本质基质套管，植入裸鼠皮下，2个月后取样，4％多聚甲醛固定后以10％EDTA脱钙，制备常规组织切片后行HE及MASSON染色，分析各组细胞移植后牙髓再生的情况。

3.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤2.1细胞的形态及表面标志物评价中通过细胞光学显微镜观察各个组的细胞的形态，原代细胞对照组和牙间充质干细胞培养基长期培养组相比于常规培养基长期培养组细胞较小，呈长梭形或纺锤形；常规培养基长期培养组细胞相比于其余两组细胞较大，形态扁平；利用流式细胞检测细胞表面标志物的表达情况，各组之间无差异。

4.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤2.2通过CCK-8实验细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色来评价细胞的增殖能力和细胞衰老；其中，牙间充质干细胞培养基长期培养组的细胞增殖能力与原代细胞对照组无差异，但高于常规培养基长期培养组；牙间充质干细胞培养基长期培养组细胞衰老和原代细胞对照组无差异，而常规培养基长期培养组细胞衰老则高于牙间充质干细胞培养基长期培养组和原代细胞对照组。

5.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤2.3通过克隆实验和细胞干性基因表达的检测对干细胞特性的评价，其中，牙间充质干细胞培养基长期培养组的细胞克隆形成能力和干性基因SOX2表达水平都高于常规培养基长期培养组。

6.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基维持牙髓干细胞的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤2.4中通过细胞划痕实验和Transwell评价三组的细胞迁移能力的评价，其中，原代细胞对照组的牙髓干细胞组的迁移能力和牙间充质干细胞培养基长期培养组的牙髓干细胞的迁移能力高于常规培养基长期培养组的牙髓干细胞组的迁移能力。

7.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤2.5通过定量分析三组干细胞的ALP活性和矿化结节形成能力，其中，原代细胞对照组的牙髓干细胞组的ALP活性和矿化结节形成能力和牙间充质干细胞培养基长期培养组的牙髓干细胞的ALP活性和矿化结节形成能力高于常规培养基长期培养组的牙髓干细胞组的ALP活性和矿化结节形成能力。

8.根据权利要求2所述的牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法，其特征在于，所述步骤3通过动物体内移植三组牙髓干细胞，评价其在动物体内形成牙髓组织的能力，其中，原代细胞对照组的牙髓干细胞组和牙间充质干细胞培养基长期培养组的牙髓干细胞组均可形成新生的牙髓牙本质组织，而常规培养基长期培养组的细胞未见有牙髓牙本质组织形成。