[发明专利]牙间充质干细胞培养基及在牙髓干细胞内的活性验证方法

说明书

本发明公开了一种牙间充质干细胞培养基，该培养基以a‑MEM为基础培养基，添加包括表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、维生素C、TGF‑β受体抑制剂LY3200882、γ‑secretase抑制剂LY411575和DNA甲基化酶抑制剂5‑Aza‑dC在内的生长因子和小分子抑制剂组合；其中，表皮细胞生长因子的含量为10‑200μg/L；血小板衍生生长因子的含量为100‑500μg/L；维生素C的含量为10‑100mg/L；TGF‑β受体抑制剂LY3200882的含量为100‑500nM；γ‑secretase抑制剂LY411575的含量为50‑200nM；DNA甲基化酶抑制剂5‑Aza‑dC的含量为1‑20nM。本发明还公开了一种牙间充质干细胞培养基在牙髓干细胞内的细胞活性验证方法。具有使用的人工合成的细胞因子，来源方便快捷，性价比高，质量稳定，无病原体及异种蛋白免疫排除问题。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体来说，涉及一种牙间充质干细胞培养基及在牙髓干细胞内的活性验证方法。

背景技术

间充质干细胞具有多向分化潜能，可以修复损伤或缺失的组织，具有很大的临床应用潜力。目前已经在牙齿中发现多种牙源性间充质干细胞。牙源性干细胞目前包括以下5种：牙髓干细胞，牙周膜干细胞，牙囊干细胞，牙乳头干细胞，脱落乳牙干细胞。其中牙髓干细胞在体外具有成骨/成牙本质分化，成脂分化，成软骨分化，成肌分化等多种潜能；并且能够在体内形成牙本质样细胞和牙髓牙本质样复合体结构。牙髓是维持牙齿活性和感知能力的重要结构，临床上牙髓常因外伤，感染等受到不同程度损伤甚至坏死。然而作为目前临床上最有效的牙髓病治疗手段--根管治疗是以人工材料替代病变牙髓，缓解疼痛，最终导致牙齿活性丢失而出现牙齿脱落。基于干细胞的组织工程技术为牙髓再生带来新的途径。牙髓干细胞是牙髓再生的良好种子细胞，移植牙髓干细胞可在体内形成新生的具有生物活性的牙髓组织，实现牙髓生理性再生。然而，原代培养的牙髓干细胞多来自于智齿或者因正畸需要拔除的年轻恒牙，尽管牙间充质干细胞来源广泛，但单个个体获取的原代干细胞数量有限，很难满足临床细胞治疗对细胞数量的需求。因此，体外大规模的长期扩增培养是牙间充质干细胞临床应用的前提。然而，常规条件下干细胞长期培养可导致细胞增殖能力下降、细胞衰老、干细胞特性降低、细胞分化能力减弱等缺陷，因此，开发出中适用于间充质干细胞长期培养的培养基，保证干细胞在体外长期培养过程中维持细胞增殖、干细胞特性和分化能力，是干细胞临床应用的关键。

目前，细胞体外扩增常使用的培养体系为基础培养基中添加胎牛血清(FBS)或人源血清。但是，含血清培养基培养的细胞在临床应用中存在诸多问题，如：成分不明确，病原微生物污染，异种或异体抗原引起的免疫反应，质量不稳定、批次之间差异大，细胞内毒素的存在等都严重影响细胞的生长和后续细胞移植的有效性和安全性。

因此，开发一种成分明确，不含血清或动物源成分，且可在长期培养过程中维持干细胞的增殖、干细胞特性、干细胞分化能力的培养基是当前干细胞临床应用的前提和关键。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种牙间充质干细胞培养基及其在牙髓干细胞内的活性验证方法，具有利用人工合成的细胞因子和小分子化合物组合加入基础培养基构成完全培养基在外长期扩增牙髓干细胞，具有维持干细胞在体内外的良好的生物活性，能够促进牙髓组织再生的优点。