[发明专利]一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法

说明书

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体方案是先利用大肠杆菌表达系统高效表达重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)，然后纯化蛋白和酶活性的测定。本发明构建的FLOD表达体系，提供了原核生物表达稳定性好的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导发酵表达、两步纯化及鉴定后获得高纯度可溶性的目标重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)。本方法所采用的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD纯度高，温度和pH稳定性好等优点。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是指一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。

背景技术

一项我国全国性的调查研究结果：目前中国的糖尿病患者已达到了9200万。这一数字使中国超越印度成为全球糖尿病人数最多的国家。而且，我国还有1.48亿糖尿病患者。作为一种慢性、终身性的疾病，糖尿病不仅会给患者带来生理和心理的痛苦，还会给国家和个人带来巨大的经济负担。随着糖尿病患者人数的增加，血糖检测的试剂也随之增加，降低血糖检测成本可缓解国家和患者的经济负担。

人体内葡萄糖与血清蛋白N-末端可发生非酶促糖基化反应，且90％糖基化反应发生在血清蛋白第189位赖氨酸，形成高分子酮胺结构，总称为糖化血清蛋白。90％以上糖化血清蛋白是糖化血清白蛋白(Glycated Albumin，GA)，因此糖化血清白蛋白可反映糖化血清蛋白总体水平。

糖化白蛋白是反映过去2-3周平均血糖水平的一项指标，比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白周期短。果糖赖氨酸氧化酶催化糖化氨基酸变成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。在此催化反应液中，加入对白蛋白有特异性的蛋白酶，发生作用从糖化白蛋白(Glycatedalbumin)生成其次，注入糖化氨基酸氧化酶从糖化氨基酸生成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。双氧水在TOOS和4AAP的混合溶液中，定量地变化成蓝紫色色素。通过测定此蓝紫色色素的吸光度而定量从糖化白蛋白生成的糖化氨基酸。

目前文献报道的果糖赖氨酸氧化酶大多酶活性和产量较低，很难实现工业化，亟待改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术缺点，提供一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：

(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；

(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；

(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。

进一步的，所述FLOD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述FLOD蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，针对FLOD蛋白的纯化包括以下步骤：

(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，高速离心获得细胞破碎液上清；

(5)Ni-NTA树脂经过平衡液平衡后，将上清液过Ni-NTA树脂纯化，纯化后进行脱盐获得重组FLOD酶洗脱液；

(6)脱盐后收集蛋白溶液，冻干处理，即得FLOD蛋白干粉。

进一步的，步骤(5)所述平衡液组成为：25mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，2mg/LFAD；