[发明专利]一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用

说明书

本发明公开了一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，每100mL溶液中含有：氨基酸类冷冻保存仿生控冰材料0.1‑50g，多元醇5.0‑45mL，DMSO 0‑15mL，血清0‑30mL，水溶性糖0.1‑1mol L^‑1，缓冲液余量。本发明的冷冻保存液以氨基酸类仿生控冰材料为主要成分，DMSO含量低，毒性小，能达与商业化冷冻保存液(含有DMSO15％)同等甚至更高的细胞存活率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞、组织冷冻保存。

本申请要求2019年4月9日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910282417.4，发明名称为“一种氨基酸类冷冻保存液及其制备方法”的在先申请的优先权。前述在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用。

背景技术

冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。除此之外，目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15％)的二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等对细胞有毒的有机溶剂，导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。

发明内容

本发明提供一种氨基酸类冷冻保存液，并提供该冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。

本发明的氨基酸类冷冻保存液，每100mL溶液中含有：氨基酸类仿生控冰材料0.1-50g，多元醇5.0-45mL，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，水溶性糖0.1-1mol L^-1，缓冲液余量。

根据本发明，所述氨基酸类仿生控冰材料选自氨基酸或者聚氨基酸的一种或两种以上。

作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸类仿生控冰材料可以为含有亲冰基团和亲水基团的氨基酸、或者含有亲冰基团的氨基酸和含有亲水基团的氨基酸组成的聚氨基酸。

所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、羧酸基(-COOH)、或酰胺基(-CONH₂)等中的至少一种；

所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH₂),苯基(-C₆H₅)，或吡咯烷基(-C₄H₈N)的至少一种。

示例性地，所述氨基酸类仿生控冰材料选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中的一或两种，或者由上述氨基酸组成的聚氨基酸；例如所述氨基酸类仿生控冰材料为精氨酸与苏氨酸的组合。