[发明专利]超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法

权利要求书

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，

所述12种类固醇激素分别为：孕酮、17a-羟孕酮、皮质酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、雌二醇、醛固酮和皮质醇；

上述12种类固醇激素对应的同位素内标物分别为：孕酮-d9、17a-羟孕酮-d8、皮质酮-d8、脱氢表雄酮-d2、硫酸脱氢表雄酮-d6、睾酮-d3、双氢睾酮-d3、雄烯二酮-13C3、雌酮-d4、雌二醇-d4、醛固酮-d4和皮质醇-d4；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的12种类固醇激素，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比，使用同位素内标法定量，准确计算出12种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：

（1）超高效液相色谱条件：

流动相A：含50μM氟化铵水溶液；流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Kinetex XB-C18 3.0×50 mm，2.6 µm；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在3.0-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.5-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至60:40；流速为0.5 mL/min；柱温为50℃；进样体积为5 µL；

（2）质谱条件：

在电喷雾电离（ESI）模式下，采用多反应监测（MRM）进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV ESI+ / 2.5kV ESI-；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800 L/h，锥孔气流速为150 L/h；同时监测了12种类固醇激素及其对应同位素内标；

所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μL血清于1.5 mL离心管，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入800µL甲基叔丁基醚进行萃取，在15℃，15000 r/min离心5min后取700 µL上清液经氮气流吹干后与80µL 50%甲醇水溶液混合，在15000 r/min离心3min后取60 µL上清液；

所述混合内标工作液按照如下方法制备：称取各同位素内标物，包括孕酮-d9、17a-羟孕酮-d8、皮质酮-d8、脱氢表雄酮-d2、硫酸脱氢表雄酮-d6、睾酮-d3、双氢睾酮-d3、雄烯二酮-13C3、雌酮-d4、雌二醇-d4、醛固酮-d4和皮质醇-d4，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL和1 mg/mL的同位素内标母液；

上述各同位素内标母液再以50%甲醇水溶液配制成包含有100 ng/mL孕酮-d9、50 ng/mL17a-羟孕酮-d8、200 ng/mL皮质酮-d8、200 ng/mL脱氢表雄酮-d2、100000 ng/mL硫酸脱氢表雄酮-d6、100 ng/mL睾酮-d3、50 ng/mL双氢睾酮-d3、100 ng/mL雄烯二酮-13C3、10ng/mL雌酮-d4、20 ng/mL雌二醇-d4、40 ng/mL醛固酮-d4和1000 ng/mL皮质醇-d4的同位素内标SI溶液；取100 µL SI溶液，加入900 µL50%甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液；

标准品按照如下方法制备：

以纯甲醇将孕酮、17a-羟孕酮、皮质酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、雌二醇、醛固酮和皮质醇配制成浓度依次为2 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、1mg/mL、10 mg/mL、2 mg/mL、1mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1mg/mL、1 mg/mL和4 mg/mL的标准品母液；

上述各标准品母液再以50%甲醇水溶液配制成包含有200ng/mL孕酮、200ng/mL17a-羟孕酮、400 ng/mL皮质酮、400 ng/mL脱氢表雄酮、200000 ng/mL硫酸脱氢表雄酮、200ng/mL睾酮、100ng/mL双氢睾酮、200ng/mL雄烯二酮、40 ng/mL雌酮、40ng/mL雌二醇、40ng/mL醛固酮和4000ng/mL皮质醇的混合标准S0溶液；

将上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述空白血清基质溶液为10%甲醇水溶液；所述校准品溶液的八个浓度点为：

孕酮、17a-羟孕酮、睾酮和雄烯二酮的浓度相同，八个浓度依次为：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml和10ng/ml；

皮质酮和脱氢表雄酮的浓度相同，八个浓度依次为：0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.4ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml；

硫酸脱氢表雄酮八个浓度依次为：50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml；

双氢睾酮八个浓度依次为：0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml；

雌酮、雌二醇和醛固酮八个浓度依次为：0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml和2ng/ml；

皮质醇八个浓度依次为：1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。