[发明专利]一种大规模回收线性化质粒的方法

说明书

本发明公开了一种大规模回收线性化质粒的方法，包括如下步骤：步骤1，限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，限制性内切酶为PvuI酶，用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；步骤3，醇沉获得线性化质粒。本发明酶切体系，以PvuI酶酶切，并控制酶切体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收率提高至92％以上，甚至超过95％，将传统的质粒回收率至少提高30％。此外，本发明的质粒回收方法适用于大规模质粒回收。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及质粒回收技术，具体为一种大规模回收线性化质粒的方法。

背景技术

现有技术中，线性化制粒回收方法主要过程为限制性内切酶酶切，酚氯仿异丙醇抽提，醇沉，过程中需要控制实验的体系及质粒的浓度，其中质粒需保持在较高的浓度，因此需控制酶切体系保持在较小的体积，一般限制性内切酶体系为NEB公司推荐的体系，酶切体系的质粒浓度较低，回收率仅为60～70％。传统的回收方法还有试剂盒回收，但试剂盒回收的话是针对微量的DNA的回收，回收柱的载体不超过20μg。另外PCR清洁试剂盒也可回收分子量在100bp-10kb左右的DNA，最高回收率可达95％，但均针对回收量在10ug以内的微量回收，对于大于10ug的回收无法保证回收率和回收量。

发明内容

为了克服上述现有技术中的问题，本发明提供一种大规模回收线性化质粒的方法。

为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：一种大规模回收线性化质粒的方法，：包括如下步骤：

步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，PvuI限制性内切酶的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；

步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；

步骤3，醇沉获得线性化质粒。

具体的，述酚氯仿异丙醇抽提包括如下步骤：

1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；

2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

3)向剩余有机相中加入ddH₂O，充分混匀；ddH₂O的用量一般与酶切体积相等；

4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；

5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合。

具体的，述醇沉方法为：首先，向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白色絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH₂O溶解。

与现有技术相比，本申请取得了如下技术效果：本发明酶切体系，以PvuI限制性内切酶进行酶切，并控制酶切体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收率提高至92％以上，甚至超过95％，将传统的质粒回收率至少提高30％。此外，本发明的质粒回收方法实现了大规模质粒回收，比如1mg质粒回收，甚至是1mg以上的质粒回收。

具体实施方式

本发明下面结合实施例作进一步详述：