[发明专利]一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因片段，对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，所述ORF1lab基因的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.1的碱基对序列；

下游引物具有SEQ ID NO.2的碱基对序列；

荧光探针具有SEQ ID NO.3的碱基对序列；

所述N基因的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.4的碱基对序列；

下游引物具有SEQ ID NO.5的碱基对序列；

荧光探针具有SEQ ID NO.6的碱基对序列。

2.根据权利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：还通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增了一个用于质控的MS2片段，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.7的碱基对序列；

下游引物具有SEQ ID NO.8的碱基对序列；

荧光探针具有SEQ ID NO.9的碱基对序列。

3.根据权利要求2所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阳性对照为合成的病毒质粒核酸序列，包括所述ORF1lab基因、N基因和MS2片段，所述SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阴性对照是无菌水。

4.根据权利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取样品；

步骤二：使用病毒RNA提取试剂，净化柱，提取和纯化样品中的RNA；

步骤三：以所述步骤二中的RNA为模板，在50度的温度下，通过反转录酶转录得到对应DNA，DNA模板在PCR反应液中，利用热启动Taq聚合酶，在设定的链式反应条件下，进行PCR循环反应；

步骤四：选择FAM，HEX，Cy5为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到Ct值。

5.根据权利要求4所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述步骤二中的PCR反应体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液中Mg²⁺浓度为3.3mM，dNTP的浓度为0.1-0.5mM，SARS-CoV-2特异性基因的上游引物、下游引物和探针上下游引物浓度为0.1-1.0M，探针浓度为0.1-0.5M，Taq酶浓度为0.5-5U/反应，每个测试20-1000个拷贝病毒基因组模板；

所述步骤二中的反应条件为：50℃RNA逆转录15min，95℃水解、热启动DNA 15min，94℃15S退火，55℃延伸。

6.一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测SARS-COV-2病毒的所述权利要求1中ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列，所述ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列作为阳性对照使用。

7.根据权利要求6所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括所述权利要求2中MS2片段的特异性引物和荧光探针序列，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列在检测SARS-COV-2病毒的过程中作为过程控制参考物使用。

8.根据权利要求7所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液、反转录酶、热启动酶、所述过程控制参考物、阴性对照和所述阳性对照。