[发明专利]一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种SARS‑COV‑2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，使试剂盒包括SARS‑CoV‑2病毒PCR反应液、Taq酶、过程对照、阳性对照及阴性对照，采用本发明的试剂盒检测环境和食品中的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2具有很好的特异性、敏感性及稳定性，检测时间2小时，PCR反应过程加液一步完成，避免反复开盖实验污染，通过更换特征引物和探针可扩展测试环境中已知的其他7种冠状病毒。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

2019年12月报道了首例COVID-19的病人病例，为乙类传染病，由SARS-CoV-2病毒引起。冠状病毒有外层脂质包膜，病毒含有为连续线型单链RNA基因。SARS-CoV-2可通过呼吸道飞沫和接触传播。根据研究报道(Persistence of coronaviruses on inanimatesurfaces and its inactivation with biocidal agents doi:10.1016/j.jhin.2020.01.022)格赖夫斯瓦尔德大学医院内科医生Gunter Kampf等科学研究发现，如果温度30度以下，且湿度合适，病毒可以在铁、铝等金属，木材、纸张、塑料和玻璃等多种材料上存活4至5天，一些动物冠状病毒甚至可以存活超过28天。因此为了确认环境清洁消毒有效，在新冠病毒疾病流行期间，对环境建立一种灵敏度高，且避免假阴性结果的SARS-CoV-2病毒检测方法显得尤其重要。

目前已知可感染人类的冠状病毒仅7种：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和这次的SARS-CoV-2。本方法选取了SARS-CoV-2的ORF1ab多聚蛋白编码ORF1ab基因及核衣壳蛋白(Nucleo capsid protein,N)基因作为特异性RNA检测目标基因，和冠状病毒(HKU1，OC43,NL63,229E)，SARS-CoV，MERS,以及人类基因DAN无交叉反应，与诺如病毒军团菌等无交叉反应。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适用环境和食品通过涂抹，提取，RT-PCR的方法监控SARS-CoV-2清洁和灭杀效果的方法，且有效避免假阴性和假阳性的误差。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒。

一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因片段，对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，所述ORF1lab基因的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.1的碱基对序列；

下游引物具有SEQ ID NO.2的碱基对序列；

荧光探针具有SEQ ID NO.3的碱基对序列；

所述N基因的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.4的碱基对序列；

下游引物具有SEQ ID NO.5的碱基对序列；

荧光探针具有SEQ ID NO.6的碱基对序列。

本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法还通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增了一个用于质控的MS2片段，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.7的碱基对序列；