[发明专利]一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法

说明书

本发明公开了一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，技术方案是，利用ALP对于磷酸基团的特异性，与AAPi反应生成抗坏血酸AA，然后，AA与DES反应产生较强荧光，从而实现对ALP活性的测定。本发明采用4,4'‑二叠氮二苯乙烯‑2,2'‑二磺酸二钠四水合物(DES)作为荧光探针，具有成本低、检测简单、灵敏度高等优点。本发明的方法具有假信号少、灵敏度高、选择性好、检测快速等优点。实验证明，本发明检测线性范围：5‑40mU/mL，相关系数为0.998，检出限1.46mU/mL，具有较高选择性和抗干扰能力，为后期应用于临床检测奠定重要基础。

技术领域

本发明涉及一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于生物组织中的膜结合酶，由于生物体内ALP水平的异常往往与许多疾病密切相关，因此被广泛用作临床诊断的生物标志物。目前在明确催化机理的基础上，研究人员建立了多种检测碱性磷酸酶活性的方法，包括电化学法、荧光法、比色法和表面增强拉曼光谱法等。在上述方法中，光学方法，特别是荧光法，具有可靠、灵敏度高、使用方便、响应速度快、仪器要求低等优点，非常适合于高通量分析和实时检测。通常，碱性磷酸酶的荧光检测方法是通过比较酶底物和碱性磷酸酶触发的水解产物的荧光响应来实现的。例如，利用ALP产物的荧光猝灭能力和Cu²⁺对焦磷酸盐和磷酸盐的区分能力，设计了许多荧光传感器。但这样的模式存在低信号输出高的检测背景以及相对较低的灵敏度和选择性等不足。

相比之下，荧光开关法由于具有假信号少、选择性好、灵敏度高等优点而备受关注。抗坏血酸2-磷酸(AAPi)是碱性磷酸酶(ALP)活性测定中最常用的特异性底物之一，在ALP存在下，AAPi可以水解并转化为抗坏血酸(AA)。与AAPi相比，酶产物AA表现出更强的还原能力，在碱性条件下更容易脱氢。利用碱性磷酸酶(ALP)对AAPi的催化水解作用和AA的还原能力，构建新兴的碱性磷酸酶荧光分析方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种简便、灵敏、快速的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是提供：一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，包括以下步骤：

(1)将AAPi溶液分别和一系列活性浓度梯度的ALP溶液混合，反应；

(2)在步骤(1)的反应液中分别加入DES溶液，反应；

(3)对步骤(2)的反应液分别进行荧光测定，构建ALP活性浓度和荧光强度的线性关系；

(4)利用线性关系，得到待检测ALP溶液活性浓度。

AAPi溶液的浓度为0.1M。

一系列活性浓度梯度的ALP溶液的活性浓度为：5、10、20、30、40mU/mL。

ALP溶液为ALP的Tris Buffer溶液，Tris Buffer溶液的浓度为0.1M，含2mMMgCl₂，0.2mM ZnCl₂，pH＝8.0。

DES溶液的浓度为15mM。

AAPi溶液、ALP溶液、DES溶液的体积比为1：4：4。

步骤(1)中反应温度为37℃，时间为50min。

步骤(2)中反应温度为37℃，时间为30min。

荧光测定的条件为激发波长383nm，狭缝2nm。

本发明的有益效果：

1、设计一种基于抗坏血酸2-磷酸(AAPi)的荧光开关法ALP检测方法，具有假信号少、灵敏度高、选择性好、检测快速等优点。