[发明专利]一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法

说明书

本发明公开了一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法，包括以下步骤：采集样本，并制备样本溶液；裂解样本溶液中的宿主细胞，并消化样本溶液释放出的DNA，通过酶法和机械法进行破壁，得到样本1；对样本溶液进行DNA酶消化，得到样本2；将样本1和样本2合并，提取总核酸；总核酸分为两部分：一部分去除rRNA，反转录为cDNA，与另一部分混合。利用本发明提出的针对二代测序的宏基因组建库样本的方法进行宏基因组测序，测序的检测能同时检测DNA和RNA病毒，以能保证不遗漏RNA病毒；检测可对样本中总核酸进行检测，检测的灵敏度高，对于样本中所有微生物均能检。

技术领域

本发明涉及宏基因组技术领域，更具体地，涉及一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法。

背景技术

目前，感染性疾病是当今世界上威胁人类健康的重点疾病。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原呈现多样化和复杂化的发展趋势，各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明原因的发热，都给人类健康带来巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病的诊断的真确性和实效性提出了更好的要求。

临床上传统的鉴定方法基于两种策略：一种是给予细胞培养的方法，作为鉴定病原微生物的金标准，但其依赖于样本，且对试验和技术条件十分严格限制其广泛应用；另一种是基于特异性引物/探针/抗体的方法，如抗原抗体反应，PCR反应，等特异性快速检测系统，但其基于特异性的方法只能检测已知的病原体，无法应对未知及人工改造的病原体，通量不够且阳性率低等短处，导致其无法解决很多临床问题。病原体的常规检测方法存在阳性率低，周期长，对操作人员的技术水平要求比较高等局限。

近年来高速发展的NGS技术因其不依赖于已知的核酸序列，无需特殊设计探针，课直接怼未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检测的局限性，在临床微生物领域展现量广阔的前景。

宏基因组学是以某一特定环境样品中的病原体群体基因组为研究对象，以测序分析为研究手段，以病原体多样性，种群结构，进化关系，功能活性，相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的病原体研究方法，宏基因组可不依赖培养，无需对病原体进行假设，同时，一旦发现病原体的基因组序列，即可实现有关溯源，耐药，毒力等多种分析，结果具有很高的实用价值，这些特点弥补了传统检测方式的不足。

但是，目前利用宏基因组技术检测病原微生物检测的灵敏度还需要进一步提高，以满足临床上的要求。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法，使得DNA和RNA一起建库上机，使得检测结果更为准去和灵敏。

本发明的目的是提供一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一种宏基因二代测序的建库样本的制备方法，包括以下步骤：

采集样本，并制备样本溶液；

裂解样本溶液中的宿主细胞，并消化样本溶液释放出的DNA，通过酶法和机械法进行破壁，得到样本1；

对样本溶液进行DNA酶消化，得到样本2；

将样本1和样本2合并，提取总核酸；

总核酸分为两部分：一部分去除rRNA，反转录为cDNA，与另一部分混合；

其中，裂解样本溶液中的宿主细胞的方法为，样本溶液与皂苷溶液混合，至皂苷的终质量浓度为0.22％～2.2％，孵育10～60min，再加入NaCl反应。

最优选地，皂苷的终质量浓度为2.2％，孵育30min。