[发明专利]一种那屈肝素钙二糖谱的检测方法

说明书

本发明属于原料药检测技术领域，具体涉及一种那屈肝素钙二糖谱的检测方法。所述那屈肝素钙二糖谱的检测方法，包括：先向样品溶液中加入混合肝素酶进行酶解完全，再采用阴离子交换色谱法对酶解产物进行检测。本发明所述方法是针对那屈肝素钙的特点，深入研究其酶解条件并选择相适配的阴离子交换色谱法对其二糖组分进行检测，不仅检测结果更准确、灵敏度更高，而且无需柱前衍生，操作更加简便。所述方法能够为原料合成工艺的探究提供结构信息，也能够有效控制那屈肝素钙的质量，使其质量达到稳定、可控、高效及安全。

技术领域

本发明属于原料药检测技术领域，具体涉及一种那屈肝素钙二糖谱的检测方法。

背景技术

肝素是从哺乳动物组织中提取的一种高度硫酸化的糖胺聚糖，低分子肝素(LMWH)是由肝素分解和降解产生的，其具有抗Ⅹa活性，但其抗Ⅱa因子活性较小，故可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成，但不影响血小板聚集和纤维蛋白原与血小板的结合。现有分级的低分子肝素制剂包括那屈肝素钙注射液、依诺肝素钠注射液、达肝素钠注射液、贝米肝素钠注射液等。

在进行该类药物的仿制研究时，有必要明确其结构。目前，低分子肝素的结构确证研究是该类药物药学研究的重点和难点，也是研发单位在该类品种申报时存在问题较多的部分。其中，二糖谱的测定对于低分子肝素类产品的结构确证非常重要。

二糖谱的测定一般采用纯化的肝素消化酶对低分子肝素进行彻底酶解，得到组成低分子肝素的二糖结构单元成分。然后可采用HPLC分析、色谱联用质谱(HPLC-MS)及毛细管电泳(CE)等方法对各个二糖结构单元进行分离和定量分析。

现有CN102323355A公开了一种酶解-HPLC法检测依诺肝素的方法，所述方法包括下述步骤：a、依诺肝素的完全酶解：向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；b、HPLC法分析：取降解产物做SAX-HPLC分析；c、二、四糖单元种类和含量的计算：根据现有的标准双糖和四糖的洗脱时间，确定供试品二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量。

虽然依诺肝素、那屈肝素钙等均属于低分子肝素，但他们与那屈肝素钙的制备工艺完全不同，特征结构存在较大的差异，简单套用依诺肝素的检测方法并不能获得较为准确的那屈肝素钙的检测结果。

而现有的其他酶解完全的研究方法，如运用薄层色谱等，灵敏度不高；HPLC分析部分需要进行柱前衍生化处理，既消耗了大量的分析时间，又带入了复杂的基质，且部分衍生反应需要极微量的反应试剂，对操作的要求较高，结果存在偶然性。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一种那屈肝素钙二糖谱的检测方法。本发明所述方法是针对那屈肝素钙的特点，深入研究其酶解条件并选择相适配的阴离子交换色谱法对其二糖组分进行检测，不仅检测结果更准确、灵敏度更高，而且无需柱前衍生，操作更加简便。

本发明所述的那屈肝素钙二糖谱的检测方法，包括：先向样品溶液中加入混合肝素酶进行酶解，再采用阴离子交换色谱法(SAX-HPLC)对酶解产物进行检测。

本发明着重在酶解完全探究方法上提出创新，通过混合肝素酶对样品进行完全酶解，再采用阴离子交换高效液相色谱法检测技术对那屈肝素钙二糖单元组成的分离和定量进行分析。通过将所得结果与标准品或者是文献中确定的二糖对比来鉴别二糖结构单元，检测商品化的8种常见二糖、那屈肝素钙的特征峰以及连接的结构域等；本发明所述的酶解完全-阴离子交换色谱法对那屈肝素钙药物的结构一致性确证具有重要的意义。

根据本发明的一些实施例，所述混合肝素酶由肝素酶Ι、肝素酶Π与肝素酶Ш等量混合；所述混合肝素酶的加入量为0.15-0.25IU/mg那屈肝素钙，优选0.2IU/mg那屈肝素钙。

根据本发明的一些实施例，所述酶解的温度为25-27℃，时间70-75h，优选72h。