[发明专利]一种大肠癌多基因筛选探针及其应用

权利要求书

1.一种大肠癌多基因筛选探针，其制备方法为：

针对大肠癌高发的高危突变基因，下载基因外显子编码序列，在3’端和5’端各增加50bp的侧翼序列；ucsc数据库中基因组版本选择hg19/GRCH37；

利用Oligowiz2.0软件处理基因序列，具体参数设定如下：-length：目标Oligo优选长度为110个碱基；-lmax和-lmin：严格限定探针的长度，必须为110bp；-minlh：软件默认值为15；程序运行的结果，重定向到owz后缀命名的文件；其中SEQ NO.1：5’-GAAGCGAGGATCAACT-3’；SEQ NO.2：5’-CATTGCGTGA ACCGA-3’；获得Output.owz文件；

利用OligoWiz-2.1.0_OFFLINE.jar软件在windows系统下打开上述Output.owz文件，选择最小探针间距为55bp，最大探针数量为无限制，其余参数都使用默认值，导出探针列表；

在探针5’端添加一条SEQ NO.1的引物序列，3’端添加一条SEQ NO.2的引物序列，然后合成探针。

2.如权利要求1所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于其中的高危突变基因包括：体细胞突变基因，见表1，以及拷贝数变异的基因，见表2：

表1检测体细胞突变的基因列表

表2检测拷贝数变异的基因列表

3.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于重点关注的体细胞突变基因为：KRAS、NRAS、BRAF、APC、CHEK2、PTEN、SMAD4、TP53、AKT3、CCND1、JAK2。

4.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于重点关注的拷贝数变异核心基因为：ERBB2、FGFR1、MYC、RB1。

5.一种大肠癌基因筛选的方法，包括：提取患者的DNA样本，包括血液样本的DNA、组织样本DNA及cfDNA；应用权利要求1至4所述大肠癌多基因筛选探针进行检测生物信息学分析，得到的结果与所述表1和所述表2所列的突变基因及拷贝数变异基因进行对比，得到患者的基因诊断结果。

6.如权利要求5所述一种大肠癌基因筛选的方法，具体包括如下步骤：

(1)DNA样本制备

提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行DNA提取，石蜡包埋组织亦可；

(2)DNA样本文库构建

将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，然后采用KAPA文库构建试剂盒进行文库制备；文库制备完成后将其置于-20℃保存；

(3)杂交捕获并测序

应用上述大肠癌多基因筛选探针，与DNA文库进行杂交捕获，由捕获磁珠实现捕获DNA片段，并送样测序；

(4)对测序结果进行生物信息学分析

测序结果为fastq文件，使用获取基因突变的算法，分析测序结果，得到基因突变的结果并注释；

主要步骤有fastq文件的质量控制，基因组联配，体细胞突变，及胚细胞突变，的分析，进行注释；

用到的软件分别有：fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制；bwa做联配，gatk及mutect2获得体细胞突变；HaplotypeCaller方法获得胚细胞突变；ANNOVAR做注释。

(5)结果比对得到突变结果

对样本的测序结果与所述表1和所述表2中的DNA筛选列表进行对比，得到该样本患者的基因突变结果。

7.一种大肠癌基因筛选的试剂盒，包含权利要求1所述大肠癌多基因筛选探针。