[发明专利]一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明提供一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用，在双功能谷胱甘肽合成酶GshF的N端和多聚磷酸激酶PPK的C端分别连接SpyCatcher和SpyTag，将修饰过的两个基因片段同时整合到同一个质粒载体上，转化获得重组大肠杆菌。本发明对获得的重组大肠杆菌进行高密度培养和诱导表达条件优化后，获得多酶复合物的最大表达，收集大肠杆菌菌体进行全细胞或者组装多酶复合物的高效催化，反应结束后直接离心或膜分离，简单回收细胞或多酶复合物后可多次重复利用。该工艺有效地节约了谷胱甘肽生产成本，通过高效重复利用提高了催化体系的利用效率，操作简单，有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程领域技术领域，尤其涉及一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的一种生物活性类三肽化合物。在生物体内，谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程，结合过氧化物及自由基以对抗氧化剂对巯基的破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。此外谷胱甘肽提高人体免疫力，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。

酶法生产谷胱甘肽具有催化周期短、转化效率高以及易纯化等优点，已经引起广泛的关注，酶法主要包括全细胞催化以及体外纯酶催化两种。2005年以来对GSH反馈抑制不敏感的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)相继被发现，该酶同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)的活性而得名(J.Mol.Biol.(2012)416,486-494)。相对于纯酶催化来说，全细胞作为催化剂具有以下的优势：1、细胞可低成本获得，不需要进一步的处理纯化；2、细胞本身可以提供许多酶合适的反应条件和并且有利于一些辅助因子再生；3、将多种酶共固定在细胞内可以增加局部酶的浓度，减少多步反应中中间产物的传递等(Microb.Cell Fact.2017,16,106；Curr.Opin.Biotechnol.2016,42,169-177)。但是细胞的重复利用率是一个重要的限制因素。细胞的固定化可以提高细胞的利用率，并且在稀有糖以及一些重要的药物前体等方面得到了广泛的应用(Biotechnology andBioengineering.2019；116:745–756.)，但是细胞的固定化一般来说过程较复杂，对酶的催化活性或许会有一定的影响。除此之外仍然存在一些其它限制GSH合成的因素，例如ATP消耗量大，成本高不利于工业化的生产。

酶法合成谷胱甘肽需要ATP作为能量供体，ATP的直接添加会极大的提高生产上的成本，因此对于酶法催化来说ATP的再生就显得极为重要。专利CN201310538982在大肠杆菌中过表达双功能谷胱甘肽合成酶(STH)以及乙酸激酶(ack)，虽然该法可以实现ATP再生的目的，但是乙酰磷酸的价格相对较高。张星等(J.Biotechnol.2017；(241)：163-169)通过将重组GshF与多聚磷酸激酶相结合，体外组成一种ATP再生系统来生产GSH的方式在45℃条件下反应5h时GSH的积累量达到了28.5mM，基于半胱氨酸的得率达到了81.4％，虽然基于添加半胱氨酸的得率较高，但是谷胱甘肽的产量相对较低。

多肽段SpyTag和SpyCatcher可通过自发反应形成共价键，从而提供了一种基因编码的方式来提供肽相互作用，该共价键可以抵抗较恶劣条件并且产生稳定的分子自组装体，在本发明中希望通过SpyTag和SpyCatcher的修饰使得GshF和PPK能够融合表达形成多酶复合物从而实现重复利用。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供将双功能谷胱甘肽合成酶以及多聚磷酸激酶在大肠杆菌中同时表达的重组大肠杆菌。

本发明第二个目的在于，提供所述重组大肠杆菌在合成谷胱甘肽中的应用。

本发明第三个目的在于，提供一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法。