[发明专利]一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法，包括下述步骤：

(1)、关节液来源的间充质干细胞的提取扩增：将收集的从膝关节炎患者关节穿刺时抽取的关节液用孔径为70um的细胞筛过滤，移至100mm培养皿中，加5ml含20％患者自体血清和1％青霉素和链霉素双抗的α-MEM培养基，混匀后转移至37℃5％CO₂培养箱培养，24h后去除表面培养基，再用PBS轻柔洗涤两次，加入完全培养基，每周换液2次，每次换液先去除培养基，用PBS轻柔洗涤两遍，再加入完全培养基；所述完全培养基组成为5％血清替代物、1％青霉素和链霉素双抗和94％MSCBM培养基；

(2)、关节液来源的间充质的扩增：待局部细胞融合率达80％-90％即可传代，去除表面培养基，再用PBS轻柔洗涤两次，加入胰酶后置于37℃5％CO₂培养箱5min；在显微镜下观察见贴壁细胞变为圆形，即可加入等量完全培养基终止消化，反复吹打，将细胞与培养皿表面完全分离；将混合液转移至15ml离心管，用离心机于4℃1500rpm 3分钟离心细胞。离心后去除细胞上清液，用完全培养基重悬细胞，置于培养皿内，将标记为P1代，于37℃5％CO₂培养箱继续培养扩增，传代至P3代即得间充质干细胞；所述完全培养基组成为5％血清替代物、1％青霉素和链霉素双抗和94％MSCBM培养基。

2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法还包括采用流式细胞技术对步骤(2)所得P3代细胞进行表型鉴定的步骤。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，对P3代细胞进行表型鉴定的具体步骤为：P3代细胞生长融合达80％-90％后，弃细胞培养上清液，加入10mlPBS清洗一次，加入3mlTrypLE，于37℃5％CO₂培养箱消化5分钟；待细胞消化悬浮于消化液后用移液管将细胞从培养皿上冲洗下来，再将消化液移至15ml离心管中，于4℃1500rpm 3分钟离心细胞；离心后去除细胞上清液；用含0.1％BSA PBS重悬细胞，调整细胞浓度为10⁶个/ml；取100uL细胞悬液至1.5mlEP管中，保证每管细胞不小于10⁵个；将细胞悬液分别与20uLCD105、CD73、CD29、CD34、CD45、HLA-DR流式抗体混匀，在避光条件下置于4℃冰箱孵育30分钟；4℃1500rpm 3分钟离心细胞，去除细胞上清液，用含0.1％BSA PBS重悬细胞；反复清洗细胞三遍；清洗完后用含0.1％BSA PBS重悬细胞，移至流式管中，进行流式细胞检测。