[发明专利]一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法

说明书

本发明一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法，属于间充质干细胞培养技术领域。所述培养方法包括：(1)关节液来源的间充质干细胞的提取扩增；(2)关节液来源的间充质的扩增。所述培养方法还包括采用流式细胞技术对P3代细胞进行表型鉴定的步骤。本发明的培养方法具有以下优点：骨关节炎关节液来源的间充质干细胞具有采集方便、处理简单、具有较好的多向分化潜能等优势，并且能够采用患者自体关节液来源的干细胞回输至自身病灶处，极大地减少了免疫排斥反应的发生率以及伦理相关问题。

技术领域

本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法；尤其涉及针对骨关节炎患者，从其患侧关节腔中分离提取并制备间充质干细胞制剂的一种方法。

背景技术

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是在全世界范围内导致残疾的主要原因，其中65 岁以上的成年人患病率约为33.6％。一项研究表示，到2032年45岁以上的成年人中有将近30％的人会患有骨性关节炎，其中50％的人将被诊断为膝关节骨性关节炎。目前国内外根据膝关节骨性关节炎的轻重程度不同会采取不同的治疗措施。对于轻中度患者，指导适当正确的功能锻炼和运动方式、口服非甾体类抗炎药、关节腔注射玻璃酸钠为主要的治疗手段。针对严重患者，常采取人工关节置换、自体软骨细胞移植等手术方式进行治疗。

随着再生医学的发展，具有低免疫原性、较强的免疫抑制性以及多向分化潜能的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)受到广泛青睐，并且MSCs在体外和体内的相关研究均已被证明对骨关节炎和软骨损伤有明显的治疗效果。根据OA人群的日益增长以及该疾病出现的年轻化趋势，一种以间充质干细胞为种子细胞来源的安全、有效、非手术的“一步式”治疗方法得到全世界范围内的关注。对于OA患者，最常采取的有效保守治疗方法是关节腔内注射玻璃酸钠。在行关节腔穿刺术时，通常先将患者患侧膝关节内的关节积液尽可能抽尽，而抽取出的关节积液会被当做医疗废物处理。

发明内容

MSCs分布较为广泛，其中在骨关节炎患者的关节液中含有丰富的MSCs。本发明的方法原本当作医疗废物处理的将关节积液回收，通过将抽取的关节液分离、培养、扩增得到足量的MSCs，经鉴定和检验后，以关节腔注射的方式回输至患者关节腔内，以达到改善关节腔内微环境和减轻患者疼痛的目的。这一方法将会是一种能够改善骨关节炎的安全、有效、便捷的新型治疗手段，并且具有广阔的医疗前景。

本发明的目的在于公开了一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种骨关节炎关节液来源的间充质干细胞的培养方法，包括下述步骤：

(1)、关节液来源的间充质干细胞的提取扩增：将收集的从膝关节炎患者关节穿刺时抽取的关节液用孔径为70um的细胞筛过滤，移至100mm培养皿中，加5ml含20％患者自体血清和1％青霉素和链霉素双抗的α-MEM培养基，混匀后转移至37℃5％CO₂培养箱培养，24h后去除表面培养基，再用PBS轻柔洗涤两次，加入完全培养基，每周换液2次，每次换液先去除培养基，用PBS轻柔洗涤两遍，再加入完全培养基；所述完全培养基组成为5％血清替代物、1％青霉素和链霉素双抗和94％MSCBM培养基；

(2)、关节液来源的间充质的扩增：待局部细胞融合率达80％-90％即可传代，去除表面培养基，再用PBS轻柔洗涤两次，加入胰酶后置于37℃5％CO₂培养箱5min；在显微镜下观察见贴壁细胞变为圆形，即可加入等量完全培养基终止消化，反复吹打，将细胞与培养皿表面完全分离；将混合液转移至15ml离心管，用离心机于4℃1500rpm 3分钟离心细胞，离心后去除细胞上清液，用完全培养基重悬细胞，置于培养皿内，将标记为P1代，于37℃5％CO₂培养箱继续培养扩增，传代至P3代即得间充质干细胞；所述完全培养基组成为5％血清替代物、1％青霉素和链霉素双抗和94％MSCBM培养基。