[发明专利]用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法

说明书

一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒，所述化学发光试剂盒采用双单抗夹心法检测尿液中的微量触珠蛋白，所述化学发光试剂盒包括化学发光板、酶标单抗溶液、标准品溶液和发光底物，所述化学发光板采用稀释后的单克隆抗体5C4包被，并采用封闭液封闭，所述酶标单抗溶液包括由HRP标记的单克隆抗体HRP‑1A2和抗体稀释液，所述单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2为可识别人类天然Hp分子结构表位的单克隆抗体。本发明化学发光试剂采用双单抗夹心法检测尿液中Hp含量，利用单克隆抗体5C4和1A2作为双单抗体，此对单克隆抗体可特异性识别人类Hp分子结构表位，结构表位抗体可特异性的检测非变性的Hp分子，检测准确度高，偏倚值为‑6.78％～10.12％。

技术领域

本发明涉及一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法，属于生物医药诊断技术领域。

背景技术

触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)又称结合珠蛋白，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中。在CAM电泳及琼脂糖凝胶电泳中，触珠蛋白位于α2区带，分子中有两对肽链(α链与β链)共同形成α2β2的四聚体。Hp的分子结构受遗传控制，人类存在两种不同的等位基因Hp1和Hp2。因此，形成了三种Hp基因型：Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2。

触珠蛋白的主要功能是与游离血红蛋白结合成复合物并通过与CD163分子结合提呈给单核-巨噬细胞系统处理，从而可以去除血液循环中的游离血红蛋白，避免其对肾脏的损害。研究显示不同基因型的Hp结合血红蛋白的能力不同，其中以Hp1-1最强，Hp2-2最弱。Hp在临床上常用于诊断血管内溶血性疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和蚕豆病，以及先天性无结合珠蛋白血症等。同时，Hp还是一种急性时相蛋白，当机体处在应激状态时，血液中的结合珠蛋白明显增多，如心肌梗塞、肿瘤、炎症、创伤、感染等病理状态时，以及应用某些激素，如皮质激素和雄性激素后，其血清含量常有显著升高，并与严重程度和预后有关。

近年来，随着蛋白组学技术的广泛应用，Hp更多的新功能被人们认识和发现。尤其是在糖尿病领域，研究发现Hp是糖尿病患者血管并发症易感的决定因素之一，弥补了传统预测因素无法早期预测远期预后的不足。其中美国学者、新加坡学者和中国学者(北京同仁医院杨金奎教授)三个独立的研究团队先后实验证实尿液Hp浓度是2型糖尿病肾病敏感的早期标志物，其中杨金奎团队率先证明了尿Hp与糖尿病视网膜微血管病变的关系，其研究内容为《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》所采纳。因此尿Hp的检测对糖尿病并发症(视网膜病变和肾病)早期诊断和预防具有非常重要的意义。

目前，用于检测血液Hp含量的测定试剂盒的检测原理基于散射比浊法：血清中包含的Hp蛋白与试剂中的特异性抗体结合形成免疫复合物，这些免疫复合物会使穿过标本的光束发生散射，散射光的强度与血清中Hp浓度成正比，通过与已知的标准Hp浓度对比可计算出血清中Hp的含量。但是，由于受到散射比浊方法学的限制，虽利于自动化，但检测灵敏度较差，只能检测μg/mL级浓度水平的Hp，对于浓度低至ng/mL的尿液Hp无法完成精确分析。另一种可用于Hp含量分析的试剂为触珠蛋白ELISA检测试剂盒。该试剂盒采用单克隆抗体包被空白酶联板，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体为检测抗体，通过两步法的方式检测体液中的Hp浓度。此检测法的操作简便，无需复杂仪器，可稳定检测浓度低至0.2ng/mL的Hp蛋白。但是，此检测试剂也存在明显的不足：⑴检测效率低下，需要较长的检测时间；⑵检测抗体为多克隆抗体，稳定性差，导致不同批次的试剂检测一致性较差；⑶与小鼠Hp有0.855％的非特异性交叉反应；⑷无法实现自动化检测。尿液Hp浓度分析对糖尿病肾损伤早期诊断具有重要的意义，目前还不存在适合于临床实验室使用的用于检测尿液低浓度Hp的自动化方法。

发明内容