[发明专利]一种高产9-OHAD的分枝杆菌及其构建的方法

权利要求书

1.一种高产9-OHAD的分枝杆菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)RNA提取和RT-qPCR分析

使用RNAprep纯细胞/细菌试剂盒(TIANGEN)从甾醇转化培养基的分支杆菌中分离RNA；根据试剂盒说明书操作，将不同样品的总RNA浓缩在30μL不含RNase的水中；使用NanoDrop(NanoDrop 2000，Thermo)和1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量；

使用FastQuant cDNA试剂盒(TIANGEN)逆转录1μg总RNA；根据试剂盒说明书，用DnaseI预处理总RNA样品：2μL5×gDNA缓冲液，1μg总RNA，用ddH2O调节至10μL，在42℃温育3min，然后立即冷却冰；然后制备逆转录反应混合物：2μL10×Fast RT缓冲液，1μLRTEnzyma Mix，2μLFQ-RT引物MIX，1μg总RNA，用ddH2O调至20μL，42℃保温15min，然后在95℃下孵育3分钟，然后立即在冰上冷却；-20℃保存；在NanoDrop定量前稀释混合物10倍；

设计基因特异性qRT-PCR引物，并使用SuperReal PreMix Plus试剂盒(SYBR Green)(Tiangen)在cfx96(BioRad)中进行qRT-PCR；将2μL上述cDNA样品与0.6μL+0.6μL特异性寡核苷酸、10μL2×SuperReal PreMix Plus和6.8μL不含RNase的ddH₂O在20μL反应混合物中完全混合；RT-qPCR反应在15分钟的预变性，40个循环的95℃下进行10秒；60℃20秒；72℃，20秒；接着是55℃至95℃的熔融曲线阶段；对照组是在甘油碳源中生长的菌株，测试组是在植物甾醇碳源中生长的菌株；每个样品一式三份进行分析；使用2-ΔΔCT方法以16SrRNA基因的扩增子作为内部对照计算相对表达水平；

(二)敲除kstd菌株的构建

构建M.mycobacterium MS136的靶向基因缺失突变体；为了删除kstd1或kstd3，首先，通过引物kstd1-up-f/kstd3-up-r或kstd1-down-分别克隆上游序列1112bp或1361bp的两个片段，下游序列1057bp或1293bp；kstd3-downf/-r；然后通过XbaI酶将片段连接至2175bp或2656；随后，用HindIII/NotI消化2175bp或2656bp片段，然后克隆到质粒p2NIL中；最后，将使用来自pGoal19的PacI单消化的选择标记盒插入p2NIL的PacI位点，以产生同源重组质粒pdel-kstd1或pdel-kstd3；碱处理后，如Gordhan和Parish所述，通过电穿孔将质粒转移到分枝杆菌细胞中；在两步选举过程后，选择kstd1或kstd3的缺失突变体,命名为Mutkstd1或Mutkstd3，并使用引物kstd1-fr或kstd3-fr通过PCR确认；最终通过基因测序确定正确的Delkstd1或Delkstd3菌株，以证实kstd1或kstd3基因已经从其原始的1689bp成功地删除至526bp或1797bp至380bp；

(三)甾醇代谢相关基因表达载体的构建

使用Hsd-pfpr，BamHI-HindIII消化从MS136的基因组克隆基因3β-Hsd，并将其连接到BamHI-HindIII位点的质粒pMV261中；将pMV261和pMV261-Hsd的质粒导入MS136，分别得到MS136和MS136-H；使用5α-reductase-pfpr，cyp125-pfpr，fadD19-pfpr，fadA5-pfpr，kshA-pfpr和kshB-pfpr；从MS136的基因组克隆基因5α-4std，cyp125，fadD19，fadA5，kshA和kshB；通过相同的方法构建MS136-C，MS136-F，MS136-S和MS136-AB的菌株；使用Hsd-gfgr，5α-reductase-gfgr和kshA-gfkshB-pr和hsd-g，5α-reductase-g和kshAB-g；使用BamHI-SpeI，XbaI-XhoI和XhoI-HindIII分别消化上述三个片段，并在BamHI-HindIII位点连接到质粒pMV261中；将pMV261-H+S+AB的质粒导入Delkstd，得到MS136-H+S+AB；

(四)分枝杆菌电转化

电转杯(2mm)的处理：用75％的酒精喷洗电转杯，超净工作台紫外下晾干，放入冰盒中冰浴10min；取分枝杆菌感受态一管置于冰盒冰上，同时待电转质粒于冰上静置10min；将加入质粒的感受态吸附到电转杯中；设置电转仪参数电压1800V，将电转杯放入电转仪槽，电转2次；电转后冰浴3min中，超净工作台中加入800uL的种子培养基，30min，170r摇床中复苏2-3h；4000rpm离心5min，弃掉上清，留100uL左右，将细胞重新悬浮，用移液枪吸到含有相应抗生素的固体培养基平板上，涂匀至近干，5-7天后可见菌落生长，挑菌验证；

(五)样品的提取、检测与定量

产物的处理：取发酵液500uL置离心管中，4000rpm离心15min，用注射器吸取上清液经0.22um水系膜过滤到一个干净的离心管中，备用；吸取10uL的滤液加入到990uL的稀释剂中，充分混匀，用于后续的分析检测；其余滤液放于-20℃保存；

产物9-OHAD的检测：9-OHAD在240nm紫外波长下有特征吸收峰，而底物植物甾醇无特征吸收，所以采用HPLC法制定标准曲线对产物进行定量分析；色谱条件：色谱柱：C18(250mm×4.6mm)，检测波长：240nm，柱温：50℃，流速：1.0mL/min，流动相：乙醇：水：冰乙酸(520:480:0.1)，稀释剂：乙腈：水(50:50)，进样量：20uL；

引物序列如下：