[发明专利]一种高产9-OHAD的分枝杆菌及其构建的方法

说明书

本发明公开了一种高产9‑OHAD的分枝杆菌及其构建的方法，其特征在于，包括下列步骤：（一）RNA提取和RT‑qPCR分析；（二）敲除kstd菌株的构建；（三）甾醇代谢相关基因表达载体的构建；（四）分枝杆菌电转化；（五）样品的提取、检测与定量。本发明首次提出模块化改造分枝杆菌构建高产9‑OHAD菌种，并鉴定了多个基因与9‑OHAD积累的关系。通过在分枝杆菌中过表达3β‑HSD，5α‑reductase和KSH基因，同时敲除kstd基因，从而提高9‑OHAD的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

技术领域：

本发明涉及一种高产9-OHAD的分枝杆菌及其构建的方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

甾体是广泛存在于自然界中的一类天然化学成分，随着越来越多疾病的出现，甾体激素类药物已逐渐发展成为医药领域的重要门类。放线菌在利用与代谢异型生物质时表现出区别于其他类菌种的天然优势，在某些情况下，甾醇也可作为微生物的碳和能量来源。分枝杆菌就可以利用天然甾醇或一些其他甾体化合物作为唯一的碳和能源。分枝杆菌分解代谢途径的中断导致一些重要中间体的过度积累，如AD和9-OHAD，可用作生产甾体激素药物的前体。

随着甾体降解基因簇的揭示，其中关键酶的功能被逐一鉴定，人们已经成功的将基因簇的绝大部分基因与甾类代谢通路准确关联，准确的阐释了多步降解反应的发生机制。研究表明，一个甾体分子彻底降解为小分子能量物质的过程共四步：甾醇分子的摄取；甾核的开环反应；开环甾核的降解；侧链基团的氧化。研究认为，放线菌摄取环境中甾类物质的主要方式是生物接触，它们可以通过产生和分泌一些特殊的表面活性剂，增进疏水性甾醇分子进入细胞膜磷脂层的效率。此外，胞外存在的胆固醇氧化酶或脱氢酶也是有利于甾醇转运的积极因素之一。甾醇的支链降解是个类似脂肪酸β-氧化的过程，以1单位β-谷留醇为准，在其降解至中间物9-OHAD时，共经历十几步酶促反应，可产生3单位丙酰CoA以及1单位乙酰CoA。一些重要的实验发现，细胞色素P450 cyp125基因参与了类固醇C26羧酸的形成，该基因的缺失将导致4-胆甾烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)的积累，不能继续转化胆固醇的侧链；FadA5是分枝杆菌基因簇中的硫解酶，属于酞基CoA转移酶家族，当FadA5敲除时，硫解反应即出现被完全阻断的迹象，可推测FadA5为作用C24-C22硫解反应的关键因子；Thomas等人证实结核杆菌H37Rv中，位于igr操纵子内的fadE28-29是编码C22-酮基中间体化合物脱氢酶的关键基因，是结核分枝杆菌利用胆固醇的关键因子。Van der Geize等人通过鉴定Rhodococcus sp.RHA1的转录组，发现其中与侧链β-氧化有关的一组基因(hsd4A，hsd4B，fadD19，fadE26，ltp3)显著上调。研究发现红球菌DSM43269中fadD19基因编码中的一种辅酶连接酶，参与侧链β-氧化。甾类物质的代谢同时开始于甾核的开环与侧链的末端氧化，而甾核的开环反应则开始于胆固醇氧化酶(或脱氢酶)的作用，其次是接连发生的脱氢和羟基化反应。甾核上的第一步反应是将胆甾-5-烯-3-醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮的变化实质包括胆甾-5-烯-3-醇的生成与自身异构化为胆甾-4-烯-3-酮两个过程。此过程需要胆固醇氧化酶(Cho)和3β-羟基甾体脱氢酶/异构酶(3β-HSD)的参与。经过胆固醇氧化酶(Cho)和3β-羟基甾体脱氢酶/异构酶(3β-HSD)的催化后，甾醇氧化为4-烯-3-酮结构的甾酮，由此开始甾环的降解，包括3-甾酮-脱氢酶(KstD)与3-甾酮-9α-脱氢酶(KSH)的作用，形成9α-羟基-1,4-二烯甾体(9-OHADD)的不稳定结构，在无酶催化下就会发生甾核的开环。如上所述，9-OHAD的积累受到三个模块的影响(甾醇分子的摄取；侧链基团的氧化；甾核的开环反应)，以前的研究主要集中在甾核的开环反应，即3-甾体-9a-羟化酶(KSH)的过表达和3-甾体-D1-脱氢酶的敲除(KstD)，对于甾醇分子的摄取和侧链基团的氧化的研究相对较少。最近，已经发表了对涉及分枝杆菌细胞的类固醇分解代谢的酶进行了代谢工程的成功研究。Yao等在敲除KSTD增强KSH活性后，新菌种在144小时内从15g/L植物甾醇的转化产生7.33g/L 9α-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮(9-OHAD)。