[发明专利]促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法

权利要求书

1.透明颤菌血红蛋白对提供微生物表达甲萘醌-7方面的应用。

2.含有透明颤菌血红蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌。

3.一种提高分泌甲萘醌-7的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有透明颤菌血红蛋白基因。

4.促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)出发菌株BSMK_9的构建

(1)在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因

首先以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-U2q，yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2，yxlA-menA-D1q/yxlA-menA-D2，yxlA-menA-G1q/yxlA-menA-G2扩增片段U(1115bp)、A(1057bp)、D(1053bp)、G(806bp)；以质粒pUC57-1.8k-P1为模板，用引物yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2扩增含有启动子PlapS的片段P(442bp)；以BS168NUm的染色体为模板，用引物yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)；然后通过重叠PCR方法，利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-2，将片段U、P和A拼接成片段UPA(2614bp)；再利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD(3667bp)；最后利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-G2将片段UPAD、片段CR和片段G拼接成片段UPADCRG(6542bp)；将UPADCRG片段转化受体菌BS168NU的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得menA基因在yxlA位点整合的重组菌株MK3；在B.subtilis染色体的yjoB位点过表达dxs基因、在ydeO位点过表达dxr基因、在yqaL位点过表达yacM-yacN基因、在pksJ位点过表达glpK基因、在pksL位点过表达glpD基因、在iolI位点过表达aroG基因、在iolE位点过表达pyrG基因、在yqaQ位点过表达hepS基因的方法类似于在yxlA位点过表达menA基因；

(2)dhbB基因的敲除

以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物dhbB-U1/dhbB-U2、dhbB-D1q/dhbB-D2和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(1003bp)、D(815bp)和G(605bp)；以BS168NUm的染色体为模板，用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR)的片段CR(2069bp)；首先通过重叠PCR，利用引物dhbB-U1/dhbB-D2，将片段U和D拼接成UD(1818bp)；然后利用引物dhbB-U1/dhbB-G2，通过重叠PCR方法，将上述三个片段UD、GR和G拼接成UDCRG(4492bp)；将UDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123的感受态细胞，最终筛选获得基因dhbB被敲除的重组菌株MK3-MEP123-ΔdhbB；mgsA基因及araM基因的敲除类似于dhbB的敲除；通过依次过表达上述10个基因并敲除3个基因后最终获得重组菌株BSMK_9；

(二)过表达透明颤菌血红蛋白基因vgb

首先以出发菌BSMK9的染色体为模板，分别用引物cyd-vgb-U1/cyd-vgb-U2、cyd-vgb-D1/cyd-vgb-D2和cyd-vgb-G1q/cyd-vgb-G2扩增片段U，如SEQ ID No.11所示，1149 bp；扩增片段D如SEQ ID No.12所示，1028bp；和扩增片段G，如SEQ ID No.13所示，1163bp；以BS168NUm的染色体为模板，用引物cyd-vgb-CR1q/CR2扩增片段CR，如SEQ ID No.14所示，2069bp；以质粒pUC57-Simple-VHb为模板，用引物cyd-vgb-1/cyd-vgb-2扩增含有启动子TP2表达盒及透明颤菌血红蛋白基因vgb的片段PV，如SEQ ID No.15所示，689bp；然后通过重叠PCR方法，拼接成UPVDCRG，6058bp；用UPVDCRG片段转化受体菌BSMK_9的感受态细胞，最终筛选获得vgb基因在cyd位点整合的重组菌株BSMK_11；UPVDCRG片段序列如SEQ ID No.16所示；

PCR引物序列如下：

Primer	Number	Sequence(5'→3')
cyd-vgb-U1	SEQ ID No.1	GTGACAGAACCGACAATAAG
cyd-vgb-U2	SEQ ID No.2	CCATCAACGCAACCATAAAC
cyd-vgb-D1	SEQ ID No.3	CAGGAGCAGATTAGAGGAAA
cyd-vgb-D2	SEQ ID No.4	TGGATGGTAGATGCGAATG
cyd-vgb-G1q	SEQ ID No.5	GCACGAAAACTGAATGAATAAGGAATCACAACCGATGAAA
cyd-vgb-G2	SEQ ID No.6	CACACCGCCAAGTATAGAA
cyd-vgb-CR1q	SEQ ID No.7	ACATTCGCATCTACCATCCATCTTCAACTAAAGCACCCAT
CR2	SEQ ID No.8	TTATTCATTCAGTTTTCGTG
cyd-vgb-1	SEQ ID No.9	GTTTATGGTTGCGTTGATGG
cyd-vgb-2	SEQ ID No.10	TTTCCTCTAATCTGCTCCTG

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