[发明专利]促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法

说明书

本发明公开了一种促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌‑7的基因修饰方法，包括下列步骤：（一）出发菌株BSMK_9的构建；（二）过表达透明颤菌血红蛋白基因vgb。本发明以来源于枯草芽孢杆菌168的BSMK_9为出发菌株，通过过表达透明颤菌血红蛋白，促进细胞胞内氧的传输和提高氧的利用效率，考察其对MK‑7合成的影响；并通过优化碳源组合及上罐发酵，促进MK‑7的最大合成量，为将来遗传改造及发酵优化纳豆芽孢杆菌构建MK‑7高产菌株提供理论依据。

技术领域：

本发明涉及一种促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法及其重组菌，属于生物 基因工程领域。

背景技术：

天然的脂溶性维生素K包括植物来源的维生素K1(又称叶绿醌，PK)和细菌来源的维生 素K2(又称甲萘醌，MK)。根据侧链中异戊二烯单元数量的不同，共有14种甲萘醌，记为MK-n，常见的有MK-4和MK-7等。在原核生物中，MK-n参与呼吸链的电子传递。对于人类和 其他哺乳动物，由于维生素K是血液和骨骼中特定蛋白的谷氨酸残基翻译转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)的重要辅因子，因此用来维持钙稳态、抑制血管壁钙化、支持内皮完整性、促进骨矿化，并参与组织更新和细胞生长控制。常见的维生素K依赖性蛋白包括凝血因子(II、VII、IX、X和凝血酶原)、蛋白C和蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白(MGP)、骨膜素等。 有研究表明，尽管食物中的PK含量较高，但与MK-n(尤其是MK-7)相比，PK的生物活性较 差；长链MK-n如MK-7对正常凝血的作用比PK和MK-4更持久。因此，由于其半衰期长、生 物利用度好，MK-7在食品、制药和保健行业更受欢迎，被广泛用作膳食补充剂或药物，用于 治疗骨质疏松症、动脉钙化、心血管疾病、癌症和帕金森精神病等。

传统的MK-7生产方法包括化学合成法和微生物发酵法。虽然化学合成法生产MK-7的工 艺在不断地创新，但是产率低、副产物多、有机溶剂残留、生产环境危险、环保存在隐患的 缺陷并没有彻底解决，制约了MK-7的生产和应用。而微生物大规模、高密度连续深层发酵(主 要以纳豆芽孢杆菌发酵为主)生产MK-7由于质量可控、安全、绿色、天然等特点而更具优势。 Sato等从日本食物纳豆中分离出菌株B.subtilis，通过传统诱变筛选出甲萘醌抗性菌株， 在7L罐中发酵4天可产35mg/L的MK-7；筛选出的二苯胺抗性菌株，上罐37℃发酵1天， 45℃发酵5天可产60mg/L的MK-7。Song等筛选出的1-羟基-2-萘甲酸抗性突变株B.subtilis natto，在500mL瓶中发酵72小时可产3.593±0.107mg/L的MK-7。Luo等对分离出的 菌株Bacillus natto的发酵培养基及发酵条件和MK-7的萃取方法进行优化，在5L反应器 中发酵72小时可产32.2mg/L的MK-7。最近也有研究通过代谢途径工程的方法，来提高解 淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中MK-7的产量。Xu等从中国豆豉中分离出6 株产纤维蛋白原酶的B.amyloliquefaciens菌株，发现菌株B.amyloliquefaciens Y-2能 够产生7.1±0.5mg/L的MK-7。序列分析表明以下六个酶经历了错义突变：MenA，MenC，MenD，MenE，MenH，HepS。通过在枯草芽孢杆菌168中过表达菌株Y-2的这六个酶，发现MenA的过表达使得MK-7的含量增加1.6倍，优于其它酶；在解淀粉芽孢杆菌Y-2中过表达自身的这六个酶，发现HepS的过表达导致MK-7的产量最高，达到273±5.4克/干细胞重量(DCW)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种基因修饰方法，具体是将透明颤菌血红蛋白 (Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)基因克隆到枯草芽孢杆菌内，并考察对菌株生长及MK-7 产量的影响。

本发明提供的促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法，包括下列步骤：

(一)出发菌株BSMK_9的构建

(1)在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因