[发明专利]筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的iELISA方法

说明书

本发明公开了一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的iELISA方法，包括如下步骤：(1)将山羊支原体山羊肺炎亚种1801菌株接于MTB培养基中扩培后，菌液离心、灭菌、PBS超声重悬，分离得到抗原；(2)用所述抗原包被酶标板，37℃温箱1h后4℃过夜；加入封闭液，37℃封闭2h；加入200倍稀释的血清样品，37℃孵育1h；加入用5％脱脂奶粉稀释5000倍的兔抗羊二抗，37℃孵育1h；(3)用PBST洗板后加入TMB显色液，37℃孵育10min；加入终止液终止反应；酶标仪读取OD_450nm值。本发明iELISA方法敏感性可达98％，操作简单，样本处理量大，不仅可用于Mccp和Mo两种病原血清学阴性羊的筛选，还可用于实验中Mccp抗体水平的监测。

技术领域

本发明属于兽医检测技术领域，尤其涉及一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的iELISA方法。

背景技术

我国是世界上绵羊和山羊饲养量、出栏量最多的国家，2017年存栏量达30231.7万只，但是羊在养殖过程中易出现多种呼吸道疾病，其中羊肺炎是临床上最常见的疾病，对养羊业的影响极大。羊肺炎可分为病毒性、细菌性、支原体性以及寄生虫性四种，在我国，临床上引起羊肺炎的支原体主要有两种：绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo)和山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae，Mccp)，这两种病原山羊和绵羊都能感染。

在进行针对Mo和Mccp两种病原的疫苗以及诊断技术的研究工作中，实验前期筛选阴性羊的准备工作和后期抗体水平变化的监测都需要用到血清学检测方法，除此之外一些临床样品也需要进行血清学初检。目前，可供选择的常用血清学方法包括：ELISA，IHA和CFT等，但现有的ELISA，IHA和CFT在检测Mo或Mccp抗体时存在如下缺陷：用于检测Mccp抗体的cELISA试剂盒虽然具有良好的敏感性和特异性，但价格昂贵，检测成本达40元/样本；IHA每次需要致敏绵羊红细胞，这往往会导致批间重复性下降；CFT的特异性和敏感性较差，甚至会出现感染羊检测结果呈阴性的现象。此外，这些方法均只能检测Mo或Mccp一种病原的血清学抗体，这意味着在筛选Mccp和Mo阴性羊时，必须进行两轮检测，花费大量人力物力，并不适用于大量样本的筛选工作。

发明内容

针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的iELISA方法，其敏感性可达98%，具有操作简单、样本处理量大的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的iELISA方法，包括以下步骤：

（1）将山羊支原体山羊肺炎亚种1801菌株接于改良泰亚氏肉汤（MTB）培养基中扩培后，菌液离心、灭菌、PBS超声重悬，分离得到抗原；

（2）用所述抗原包被酶标板，每孔100μl，37℃温箱1h后4℃过夜；弃去包被液并用洗涤液洗涤，每孔加100μl封闭液，37℃封闭2h；加入100μl 200倍稀释的血清样品，37℃孵育1h；用PBST洗板后，每孔加入100μl用5%脱脂奶粉稀释5000倍的兔抗羊二抗，37℃孵育1h；

（3）孵育后用PBST洗板，然后每孔加入100μl TMB显色，37℃孵育10min；再加入终止液终止反应；将反应后的酶标板置于酶标仪上读取OD_{450 nm}值。

优选地，所述抗原包被量为60 ng/孔。

优选地，所述封闭液为5%脱脂奶粉。

本发明进一步提供了所述iELISA方法在筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种两种病原血清学阴性羊中的应用。