[发明专利]一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法

说明书

本发明公开了一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞或鱼类活体组织进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到染色体标本。该方法制备过程简单、容易控制，制备周期短；SP600125将细胞周期阻断在分裂的早后期，染色体标本分裂相多、染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践；同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法。

背景技术

染色体标本制备是染色体观察的基础，是细胞遗传学研究的一项基本技术，在生物的进化、遗传变异、育种、个体发育、疾病诊断和治疗发挥了重要的作用。目前常规染色体标本制备一般是采用秋水仙素。秋水仙素可与微管蛋白二聚体结合，破坏纺锤体，使分裂细胞停止于有丝分裂中期。然而秋水仙素会抑制细胞的生长、促进细胞凋亡，并导致细胞死亡。同时，研究表明秋水仙素具有剧毒性(危险类别码：R26/28)，人体吸入或吞咽后极毒，中毒症状与砷中毒类似，而且现阶段还没有能够应用于临床的解毒剂。因此，亟需开发新的染色体标本制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种利用低毒性化学小分子试剂SP600125制备染色体标本的新方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞或鱼类活体组织进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到良好的染色体标本。

SP600125(C₁₄H₈N₂O)是蒽吡唑化合物，一种ATP竞争性小分子抑制剂。研究发现，SP600125对哺乳动物胚胎干细胞(ES)的干细胞特性起着重要维持作用，通过SP600125可以显著增加胚胎干细胞的自我更新。细胞体外培养的相关研究发现，培养液中加入低浓度SP600125可以抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，并且细胞生存状态明显得到改善。故而目前，作为低毒性小分子抑制剂，SP600125广泛应用于胚胎干细胞的体外培养和诱导多能性干细胞的建立。然而我们研究发现，SP600125还能够通过对P53通路和纺锤体组装检验点的调控使分裂细胞阻断在有丝分裂期。在此基础上，本发明确定了利用SP600125抑制有丝分裂制备染色体标本的可行性，并建立了鱼类/哺乳动物离体培养细胞和鱼类活体肾脏组织的染色体标本制备方法。采用SP600125制备的染色体标本具有分裂相多、染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。

上述的方法，优选的，所述采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞进行处理的具体操作，包括如下步骤：将离体培养细胞(增殖活跃的继代培养细胞为宜)接种于含细胞培养液的培养皿中，置于恒温箱中传代培养24-36h后，在所述细胞培养液中加入SP600125至终浓度为50-150μM，暗处理培养22-28h后，加入质量浓度为0.20-0.25％的胰酶进行细胞脱壁，直到显微镜下观察有大量细胞变圆后，加入细胞培养液终止消化，然后将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，离心，弃上清后获得细胞沉淀。

优选的，所述离体培养细胞的培养条件包括：细胞置于28-37℃、5％CO₂的培养箱中培养，鱼类细胞培养温度优选28℃，哺乳动物培养温度优选37℃；细胞培养液为DMEM培养基，其中鱼类优选DMEM培养基含有10vol％的胎牛血清(FBS)、1vol％的丙酮酸钠、1vol％的非必需氨基酸(NEAA)、1vol％的L-谷氨酰胺、0.1vol％的β-巯基乙醇和1vol％的青霉素/链霉素P/S(penicillin/streptomycin)；哺乳动物优选DMEM培养基含有10vol％的胎牛血清(FBS)和1vol％的青霉素/链霉素P/S(penicillin/streptomycin)。