[发明专利]一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

权利要求书

1.一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体的构建步骤包括如下：

（1）将双孢蘑菇U6启动子P_AbU6与gRNA scaffold进行重叠PCR获得P_AbU6: gRNA scaffold元件；

（2）以pRGEB32载体为骨架，将P_AbU6: gRNA scaffold元件替换pRGEB32中的Rice U3promoter: gRNA scaffold元件，得到新的载体命名为pAbGEB-V1；

（3）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V1载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子替换pAbGEB-V1载体中的Pubi10启动子，得到新的载体命名为pAbGEB-V2；

（4）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V2载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入抗潮霉素基因HygR之前，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体，即为CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，并命名新载体为pAbGEB1；

双孢蘑菇U6启动子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的双孢蘑菇U6启动子是与人类U6基因同源的双孢蘑菇U6基因启动子序列进行再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

U6-R：ACCGAGACCTCGGTCTCTCAATAGTTAACAGCGTGGATC；

所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQ ID NO:2所示，所述的双孢蘑菇GPD基因启动子为双孢蘑菇启动子GPD启动子再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：

Pgpd-F: TAGGATCCTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

Pgpd-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT ；

gRNA scaffold 扩增引物：

BsaI-U6-F：GAGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，双孢蘑菇U6启动子替换pRGEB32中的U3启动子具体步骤是将双孢蘑菇U6启动子片段与gRNA scaffold片段等比例混合，并利用重叠PCR进行二次PCR扩增，扩增后的产物进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切得到酶切产物；对pRGEB32载体进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切，酶切产物与pRGEB32载体酶切产物进行重组，得到重组载体pAbGEB-V1；

重叠PCR扩增引物：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入pAbGEB-V1，具体步骤是将扩增GPD启动子片段进行Nco I和Sbf I双酶切，同时将得到的重组载体片段进行Nco I和Sbf I双酶切，将两酶切产物进行连接，得到新的载体pAbGEB-V2；

扩增GPD启动子中扩增引物为

GPD-SbfI-F：GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-NcoI-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT。