[发明专利]一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用。本发明对双孢蘑菇序列进行分析，得到了人类同源U6启动子序列，并构建了能高效表达Cas9蛋白和gRNA的CRISPR/Cas9载体，建立了一套对双孢蘑菇基因进行精确编辑的基因编辑体系。本发明的试验结果表明，本发明所建立的双孢蘑菇基因编辑体系能够成功高效的对双孢蘑菇基因AbPPO4进行基因编辑。本发明所发明的基因编辑技术可以对双孢蘑菇的基因进行精确定向编辑，能够在双孢蘑菇的育种，改良和研究中得以运用。

技术领域

本发明涉及一套用于双孢蘑菇的基因编辑系统及其应用。

背景技术

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又称白蘑菇、口蘑等，是世界上人工栽培最广泛、产量和消费量最大的食用菌，也是我国最大的出口创汇食用菌。双孢蘑菇子实体富含蛋白质以及18种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，其味道鲜美，低脂低热，被冠以“植物肉”的美誉风靡世界。目前，根据国际蘑菇科学学会（The International Society for MushroomScience，ISMS）统计，双孢蘑菇是目前世界上栽培面积最广的蘑菇之一，全球双孢蘑菇的总产量为483万吨，其中我国双孢蘑菇产量为250.5万吨，位居世界第一，同时也占同期国内食用菌总产量的7.2%。国内食用菌产业主要以木腐菌为主，对木料的需求较大，造成了严重的环境压力也制约了行业的发展。双孢蘑菇可以利用秸秆等草本原料进行栽培，环境需求低，适合大规模工厂化生产，因此，双孢蘑菇的产业发展和推广在我国具有巨大的潜力。然而，我国双孢蘑菇产业现在正面临着大而不精的问题，产量大但单位产量距离国际水平仍有很大差距。其原因之一便是菌种质量不高，如何获得适应国内生产环境的优质菌种是双孢蘑菇产业中一个十分重要的问题。因此，开发双孢蘑菇育种相关技术就具有重要意义。

目前，在双孢蘑菇的育种方面，国内外主要都是采用杂交育种的方法对双孢蘑菇菌种进行改良，利用不育的同核体孢子进行杂交配对得到可育的异核体，以此筛选具有优良性状的杂交种。但双孢蘑菇产生独特的双孢担子，难以获得用于杂交的同核体孢子，因此限制了杂交育种在双孢蘑菇育种中的运用，并且杂交育种操作繁琐，生产周期长，定向性差，已经越来越难以满足现代双孢蘑菇的生产研发的需要。因此，利用基因编辑技术在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰，是目前双孢蘑菇进行遗传改良和育种的理想途径。

目前主要的基因编辑工具有三种，分别是锌指核酸酶技术（Zinc FingerNuclease Technology, ZFNs），转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR（Clustered regμLarlyinterspaced short palindromic repeats）基因编辑技术。其中TALENs和ZFNs技术需要构建复杂的识别蛋白，成本高昂，操作复杂，因此在大型真菌中难以广泛利用。而CRISPR/Cas9技术则只需合成一段与靶向DNA同源的20个碱基，插入这个载体并转入宿主细胞，转录所产生的gRNA就能介导Cas9蛋白切割宿主细胞的目标DNA，从而达到基因编辑的目的。近几年来，CRISPR/Cas9系统已成功应用于很多动物、植物和微生物遗传改良中，例如老鼠、线虫、斑马鱼、酵母、水稻、马铃薯等。在食用菌中，关于CRISPR/Cas9技术的应用仍未见成功报道，尤其是双孢蘑菇中未有CRISPR/Cas9技术的应，主要是因为以下几点问题：（1）缺乏有效的双孢蘑菇内源表达启动子，驱动gRNA和Cas9蛋白在双孢蘑菇菌丝内表达。（2）双孢蘑菇产生双孢担子，用传统的同源重组的方法通常不能得到纯合子，因此现有技术在双孢蘑菇育种方面有极大限制。（3）目前国内外还未有建立的双孢蘑菇的基因定点编辑技术。

发明内容