[发明专利]用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其中所述多种类固醇激素为17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质醇，其特征在于，包括如下步骤：

按照步骤1)～3)的预处理方法处理得到待测液；

1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血液类样本中的所述类固醇激素；

2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；

3)碱洗后离心，取上清液冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液；

将所述待测液导入高效液相色谱中，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；

将经过所述高效液相色谱分离后的组分再结合质谱进行检测，采用同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量；

所述流动相A为含0.3v/v％甲酸的甲醇溶液，所述流动相B为含0.3v/v％甲酸的水溶液；

所述以流动相A和流动相B进行梯度洗脱的参数为：0.01min～7.00min，流动相A：40％～65％；7.00min～7.50min，流动相A：65％；7.50min～8.5min，流动相A：65％～100％；8.50min～8.60min，流动相A：100％～40％；8.60min～9.00min，流动相A：100％；其中上述条件涉及分析时间各个数值参数的浮动范围为该数值参数±20％；

所述高效液相色谱所用的色谱柱为Phenomenex Kinetex-C18，2.6μm，100×2.1mm；

所述质谱为三重四极杆质谱，针对不同检测对象的碰撞能量分别为：

17-羟基孕酮：20V～24V；雄烯二酮：28V～32V；皮质醇：18V～22V；21-脱氧皮质醇：35V～45V；11-脱氧皮质醇：33V～37V；

所述同位素内标法中定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量的操作中，所用的空白基质为25v/v％～45v/v％的甲醇水溶液。

2.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述取上清液用碱性溶液充分碱洗的操作之前，还包括将所述上清液在-50℃～-80℃条件下冰冻30min～60min。

3.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述待测液的体积为80μL～150μL；所述高效液相色谱的进样量为15μL～25μL。

4.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，离心的条件为10000rpm～13000rpm离心时间为3min～7min。

5.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所得固体组分复溶所用的复溶液体积为80μL～120μL。

6.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30℃～60℃。

7.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为0.3mL/min～0.5mL/min。

8.根据权利要求1所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述同位素内标法所采用的同位素内标为D8-17OHP、¹³C3-A4、D4-cortisol、¹³C3-11-DF以及D8-21-DF。