[发明专利]用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒。该预处理的方法包括1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血清样本中的所述类固醇激素；2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；3)碱洗后离心，取上清冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液。该方法至少能够同时分离17‑羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21‑脱氧皮质醇以及11‑脱氧皮质醇五种类固醇激素，分离效果好，操作简便。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体而言，涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒。

背景技术

先天性肾上腺皮质增生症(congenitaladrenalhyperplasia，CAH)是一组因肾上腺皮质激素合成途径中酶缺陷引起的疾病，属常染色体隐性遗传病。酶缺陷包括21-羟化酶、11β-羟化酶、3-类固醇脱氢酶、17-羟化酶缺陷等，其中21-羟化酶缺乏症(21-OHD)是CAH中最常见的类型(占90％～95％)，大多数是由于编码21-羟化酶的CYP21A2基因突变所致。其次是11β-羟化酶缺乏症(11β-OHD)，占5％～8％，其他非常罕见。

CAH主要影响皮质醇和醛固酮生成，皮质醇影响性激素的分泌，引起患儿男性化表现。醛固酮的作用则是通过肾脏对钠的重吸收，保持水钠平衡。约有75％的CAH患儿由于醛固酮的缺乏导致患儿的失盐、生长停滞、血容量减少性休克等，激素失衡还可导致对于男性化女性的性别错误判断，成年女性出现多毛、不育等问题，所以CAH的及时诊断发现和治疗十分重要。

针对常见的CAH(21-OHD和11β-OHD)二级筛查或鉴别诊断，建议同时测定17-羟基孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、皮质醇(cortisol)、11-脱氧皮质醇(11-DF)、21-脱氧皮质醇(21-DF)等多种类固醇激素。特别是同时测定21-脱氧皮质醇，在疑难性21-羟化酶缺乏症患者的鉴别诊断中非常有必要和意义，21-脱氧皮质醇是糖皮质激素合成通路中的一种中间产物，正常情况下，糖皮质激素合成的主要底物17-羟基孕酮经21羟化酶羟基化生成11-脱氧皮质醇，最终生成皮质醇；但有极少部分的17-羟基孕酮经11β-羟化酶生成21-脱氧皮质醇。在CYP21A2杂合子患者中，由于21-羟化酶活性仅是减弱或部分缺失，日常并不会有临床症状表现。针对这部分患者的产前遗传咨询很难通过临床表现或咨询发现，通过进行激发试验，大量的17-羟基孕酮无法短时间内经21-羟化酶(酶活性减弱或部分缺失)代谢，而11β-羟基酶活性正常，21-脱氧皮质醇就会堆积起来(增高)，若仅测定17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇和11-脱氧皮质醇容易漏诊，难以准确鉴别正常人群和CYP21A2杂合子患者；若能同时测定21-脱氧皮质醇、17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇和11-脱氧皮质醇，则几乎可以百分百的区分出CYP21A2杂合子患者和正常人群，对疑难21-羟化酶缺乏症患者进行鉴别诊断。

类固醇激素主要以蛋白结合的形式存在，且人体血液中含有非常多的高亲和力结合蛋白，组成成分复杂，不同激素含量差异较大，且存在较多结构类似物及同分异构体，容易互相干扰。要实现准确定量，对灵敏度和准确度有较高要求，需要选择合适的样本预处理方式富集目标物，提升灵敏度，同时还要消除或降低基质干扰。目前国内多采用免疫法测定血液中的类固醇激素，已有大量文献证实免疫法在测定类固醇激素时往往因为结构类似物和底物的干扰，造成测定结果不准确，定量限高、线性范围较窄等问题。同时每种免疫方法只能测定一种类固醇激素，检测时间长。

目前采用串联质谱法测定多种类固醇激素，一般采用以下样本预处理方法进行血液样本处理：一是样本经蛋白沉淀后再进行液液萃取，为提高提取效率，需要使用移液器尽可能多的转移萃取后上层液体，这样既增加了转移操作难度，同时也会有提取的损耗，对人员要求较高；二是样本经蛋白沉淀后进行衍生化，再进行液液萃取，虽可以提高待测物的灵敏度，但操作繁琐，人员要求高，且需要进行衍生化实验，耗时较长；三是样本经蛋白沉淀后使用固相萃取法，这种预处理方法对人员要求较高，不仅操作步骤多，且投入较大(固相萃取柱等耗材较为昂贵)。