[发明专利]一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法

权利要求书

1.一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、培养牛诱导多能干细胞：

将牛诱导多能干细胞置于二氧化碳培养箱中，在含有5％二氧化碳，温度37℃的条件下培养，每天定时更换诱导培养基，培养3～4天，将诱导培养基弃掉后，再用PBS缓冲液洗净，用1mg/mL的dispase分散酶37℃下孵育8min～10min，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞，作为培养牛初始态诱导多能干细胞的牛始发态诱导多能干细胞；

步骤2、培养牛初始态诱导多能干细胞；

将所述步骤1中得到的牛诱导多能干细胞转化为牛初始态诱导多能干细胞过程如下：将牛诱导多能干细胞用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化2min，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，在1000rpm转速条件下离心5min，离心后，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆，即为牛初始态诱导多能干细胞；

所述诱导培养基的成分及含量为：基础培养基87％KnockoutDMEM，10％KSR，Lif(10000x)，1％链霉素盘尼西林，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，巯基乙醇(1000x)，3μMCHIR99021，1μMPD0325901，8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；

其中，步骤2中所述转化培养基是在诱导培养基基础上添加12.5mg/mL胰岛素，(10x)N2supplement，1ng/mLTGF-b1，5mMSB202190,10mMSP600125,10mMSB203580，50mg/mLVitaminC。

2.根据权利要求1所述的一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于：步骤1中刮取牛诱导多能干细胞的方式为：采用枪头或细胞刮刀以Z型从左到右，从上到下将牛诱导多能干细胞从饲养层细胞上刮下。

3.根据权利要求1所述的一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于：步骤1还包括将刮取得到的牛诱导多能干细胞接种到新鲜饲养层细胞上，且接种到新鲜饲养层细胞上的牛诱导多能干细胞占刮取得到的牛诱导多能干细胞总量的1/6。