[发明专利]一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法

说明书

一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，属于干细胞培养领域，将牛诱导多能干细胞在含有5％二氧化碳，温度37℃条件下培养3～4天，弃掉诱导培养基，用PBS缓冲液洗净，分散酶37℃下孵育，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞；用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆即为牛初始态诱导多能干细胞。本发明解决了现有牛诱导多能干细胞的多能性不完全等问题。

技术领域

本发明属于干细胞培养领域，具体地涉及一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是由内细胞团(Inner cell mass，ICM)分离而来的一种具有可分化为三胚层各种类型细胞的多能性干细胞。小鼠ESCs可直接从胚胎中获取，将获得后的ESCs重新打入胚胎并移植到母体内会产生嵌合子代。对于大家畜牛而言，利用相同的培养基只能获得形态类似于小鼠表皮干细胞(Epiblast stemcells,EpiSCs)的一类干细胞，而这类细胞并不能够形成嵌合胚胎。近年来，科研人员在人、猪和猴等动物中尝试利用不同的小分子抑制剂联合筛选，获得了形态和生物学特点类似小鼠ESCs的克隆。但都是从类似EpiSCs形态的转化而来，并未从胚胎中直接获取得到。可见不同物种间，对于小分子的依赖性是不同的，换句话说，不同物种间的通路调控大相径庭。目前为止，在大家畜特别是牛中，已有报道获得了体内外可分化发育为三个胚层组织和细胞的干细胞。这些干细胞与饲养层细胞有明显的边界并且表达多能性基因如Oct4、Nanog等，但其形态仍类似于EpiSCs且不能够承受单细胞传代。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是将体细胞重编程为一种形态特点类似ESCs的一类细胞，不仅表达与ESCs相似水平的多能性基因而且具有多向分化发育的潜能。在牛上，iPSCs大多呈EpiSCs形态，具有多能性基因的表达，接受机械传代方式。这与真正的ESCs还相差很远，所以，为了获得生物学特性更接近早期胚胎的牛iPSCs，首先需要获得形态特点类似于小鼠iPSCs/ESCs的克隆。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，解决了现有牛诱导多能干细胞的多能性不完全等问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、培养牛诱导多能干细胞：

将牛诱导多能干细胞置于二氧化碳培养箱中，在含有5％二氧化碳，温度37℃的条件下培养，每天定时更换诱导培养基，培养3～4天，将诱导培养基弃掉后，再用PBS缓冲液洗净，用1mg/mL的dispase分散酶37℃下孵育8min～10min，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞，作为培养牛初始态诱导多能干细胞的牛始发态诱导多能干细胞；

步骤2、培养牛初始态诱导多能干细胞；

将所述步骤1中得到的牛诱导多能干细胞转化为牛初始态诱导多能干细胞过程如下：将牛诱导多能干细胞用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化2min，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，在1000rpm转速条件下离心5min，离心后，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆，即为牛初始态诱导多能干细胞。