[发明专利]一种牡丹类2S白蛋白及其提取方法和应用

权利要求书

1.一种牡丹类2S白蛋白，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的牡丹类2S白蛋白的提取方法，其特征在于：

（1）脱脂处理

将牡丹籽或牡丹籽粕粉碎成粉后，以料液比为1:4～1:6g/mL加入正己烷进行脱脂，得到牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉；

（2）PBS缓冲液浸提

按料液比为1:6～1:16g/mL，向步骤（1）所得牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉中加入0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，在0～4℃下提取10～14h，提取完后匀浆60～180s，离心分离取上清液，得到蛋白提取液；

（3）硫酸铵法分步沉淀粗蛋白

向步骤（2）所得蛋白提取液中添加硫酸铵至饱和度为20%，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为40%，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；再向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60%，0～4℃下静止1.5～2h，离心分离弃去上清液，获得粗蛋白；

（4）粗蛋白透析除盐

将步骤（3）中所得粗蛋白用0.01～0.04mol/L pH 6.5～7.5的PBS缓冲液在0～4℃下透析除盐后真空冷冻干燥；

（5）DEAE阴离子交换层析

将步骤（4）中冷冻干燥后的蛋白用0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液溶解后，用0.45 μm滤膜过滤，然后用DEAE阴离子交换色谱柱纯化，纯化条件为：先以3～4倍柱体积的0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液平衡色谱柱，然后进行梯度洗脱，流动相A为0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，流动相B为含有0.5～1.0mol/L NaCl的0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，洗脱梯度选择A:B由100:0到85:15到0:100，收集A:B=85:15的洗脱液，用3000～3500 Da超滤管脱盐浓缩，真空冷冻干燥，得到牡丹类2S白蛋白。

3.根据权利要求2所述的牡丹类2S白蛋白的提取方法，其特征在于：步骤（2）中，按料液比为1:8～1:10g/mL，向步骤（1）所得牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉中加入0.015mol/LpH 7.0的PBS缓冲液，在4℃下提取12h，提取完后匀浆80～140s，离心分离取上清液，得到蛋白提取液。

4.根据权利要求2所述的牡丹类2S白蛋白的提取方法，其特征在于：步骤（4）中，将步骤（3）中所得粗蛋白用0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液溶解，移入分子量为3000～3500Da的透析袋，在0.01～0.04mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液中透析12～24h，透析温度为0～4℃，透析过程中换缓冲液3～4次；然后将透析除盐后的蛋白真空冷冻干燥。

5.根据权利要求2所述的牡丹类2S白蛋白的提取方法，其特征在于：步骤（5）中，将步骤（4）中冷冻干燥后的蛋白用0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液溶解后，用0.45 μm滤膜过滤，然后用DEAE阴离子交换色谱柱纯化，纯化条件为：先以3～4倍柱体积的0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液平衡色谱柱，然后进行梯度洗脱，流动相A为0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，流动相B为含有0.8～1.0 mol/L NaCl的0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，洗脱梯度选择A:B由100:0到85:15到0:100，收集A:B= 85:15的洗脱液，用3000～3500 Da超滤管脱盐浓缩，真空冷冻干燥。

6.权利要求1所述的牡丹类2S白蛋白作为非疾病诊断和治疗目的的抗氧化剂的应用。