[发明专利]一种牡丹类2S白蛋白及其提取方法和应用

说明书

本发明公开了一种牡丹类2S白蛋白及其提取方法和应用，所述牡丹类2S白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其是以牡丹籽或牡丹籽粕为原料，通过脱脂处理、PBS缓冲液浸提、硫酸铵沉淀法粗提蛋白、DEAE阴离子交换色谱纯化获得。本发明提取工艺简单，所得牡丹类2S白蛋白的纯度可达95％以上，与2S白蛋白家族具有较高的同源性，而且所得牡丹类2S白蛋白对FRAP具有良好的还原能力，对ABTS自由基、羟基自由基、DPPH自由基具有良好的清除能力，表现出较好的抗氧化活性，可作为抗氧化剂。

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，具体涉及一种牡丹类2S白蛋白及其提取方法和应用。

背景技术

牡丹为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)落叶灌木，广泛分布于河南、山东、安徽、四川、浙江等地，牡丹全身是宝，其根皮、花、叶、种子等均可被应用。牡丹籽是牡丹的种子，是一味常用中药材，牡丹籽含有芍药苷等多种活性成分，具有抗菌、消炎、镇静、镇痛、降血糖、抗过敏及免疫调节等多种药理作用。牡丹籽含油量丰富，2011年3月国家卫生部批准凤丹和紫斑牡丹籽油为新资源食品，我国油用牡丹种植面积急剧扩大，牡丹籽产量逐年提高，油脂提取后产生大量的牡丹籽粕，牡丹籽粕蛋白含量约25％。目前这些牡丹籽粕主要作为饲料原料或食用菌培养基基料，综合开发利用水平较低。

2S白蛋白是广泛分布于双子叶植物中的水溶性种子贮藏蛋白，富含精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸的。通常，2S白蛋白的分子质量在12～15kDa之间，这些分子主要是由两条多肽链组成，较短的肽链分子量在3～5kDa之间，较长的肽链分子量在8～10kDa之间。尽管2S白蛋白在亚基结构和合成上存在差异，但它们被认为是结构上同源的紧密球状蛋白，大多数2S白蛋白具有8个保守的半胱氨酸残基骨架(CX_nCX_nCCX_nCXCX_nCX_nC)，形成了4个二硫键，包括2个链间二硫键和2个链内二硫键，使得这些蛋白质的结构非常稳定和紧密。除了保守的半胱氨酸外，2S白蛋白的氨基酸序列的同源性在植物内部和植物之间相对较低。体外研究发现，2S白蛋白家族成员具有多种功能，如翻译抑制、抗菌、消化酶抑制剂和植物防御功能等。除了具有生化活性外，2S白蛋白已被用作生物活性肽合成的载体，并通过增加必需氨基酸的含量来改善粮食作物的营养特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种牡丹类2S白蛋白，以及该蛋白的提取方法，并为该蛋白提供一种新的应用。

针对上述目的，本发明提供的牡丹类2S白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其提取方法由下述步骤组成：

1、脱脂处理

将牡丹籽或牡丹籽粕粉碎成粉后，以料液比为1:4～1:6g/mL加入正己烷进行脱脂，得到牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉。

2、PBS缓冲液浸提

按料液比为1:6～1:16g/mL，向步骤1所得牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉中加入0.01～0.02mol/L pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，在0～4℃下提取10～14h，提取完后匀浆60～180s，离心分离取上清液，得到蛋白提取液。

3、硫酸铵法分步沉淀粗蛋白

向步骤2所得蛋白提取液中添加硫酸铵至饱和度为20％，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为40％，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；再向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60％，0～4℃下静止1.5～2h，离心分离弃去上清液，获得粗蛋白。

4、粗蛋白透析除盐

将步骤3中所得粗蛋白用0.01～0.04mol/L pH 6.5～7.5的PBS缓冲液在0～4℃下透析除盐后真空冷冻干燥。

5、DEAE阴离子交换层析