[发明专利]基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

微滴式数字PCR用反应预混液，包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、taq DNA聚合酶和UDG酶；

目的片段检测混合液，包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.3所示；

内标及内标检测混合液，包括作为内标的外源重组质粒，以及所述内标的扩增引物和探针，内标的扩增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，内标的探针的序列如SEQID No.6所示；

阳性对照预混液，包括作为阳性对照的含有所述目的片段的假病毒，以及稀释用的人源血浆；

阴性对照预混液，包括人源血浆；

其中，所述阳性对照，包括第一阳性对照和第二阳性对照，所述第一阳性对照的拷贝数至少是第二阳性对照的拷贝数的100倍。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目的片段的扩增引物的工作浓度为500～1000nM，所述目的片段的探针的工作浓度为200～500 nM；所述内标的扩增引物的工作浓度的为500～1000nM，所述内标的探针的工作浓度为200～500nM；所述目的片段检测混合液中目的片段的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍；所述内标检测混合液中内标的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍；所述目的片段检测混合液和内标检测混合液在试剂盒内预先混合。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人源血浆采用正常人混合血浆。

4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的应用包括以下步骤：

1）获取样本的总DNA；

2）按照预设的反应数配置微滴式数字PCR的反应混合液的总体积；

3）按照预设的反应数制备各个反应体系；

4）将各个反应体系分别进行微液滴处理；

5）对各个经过微液滴处理的反应体系进行微滴式数字PCR扩增之后，根据扩增结果计算各个样本的核酸浓度。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述样本来源于人源血清和/或血浆；阳性对照和阴性对照需跟样本一起提取，在提取步骤之前加入内标；所述获取样本的总DNA，通过核酸提取试剂盒进行抽提。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述预设的反应数的计算方法为待检样本数、阳性对照数以及阴性对照数的总和再加1；所述微滴式数字PCR的反应混合液包括微滴式数字PCR用反应预混液、目标片段检测混合液、内标检测混合液和无核酸酶水。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系均需同时设置阳性对照和阴性对照；所述阳性对照来源于试剂盒内的阳性对照预混液；阴性对照来源于试剂盒内的阴性对照预混液；所述将各个反应体系进行微液滴处理时，每个反应体系的总微液滴数大于或等于50000，则确认微液滴生成有效。