[发明专利]基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒

说明书

本申请公开一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括:微滴式数字PCR用反应预混液；目的片段检测混合液，包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.3所示；内标及内标检测混合液，包括作为内标的外源重组质粒，以及所述内标的扩增引物和探针，内标的扩增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，内标的探针的序列如SEQ ID No.6所示；阳性对照预混液；阴性对照预混液；本申请优化利用数字PCR技术针对EB病毒进行绝对定量检测的成品试剂盒，为EB病毒相关疾病诊断提供准确的诊断依据。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒。

背景技术

EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus4 (HHV-4))。EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如Burkitt 淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。

鼻咽癌是我国南方及东南沿海地区高发的头颈部恶性肿瘤，全世界约 80%的鼻咽癌都发生在我国，严重威胁人民的生命健康。鼻咽癌对放射治疗比较敏感，随着放疗技术的不断发展，早期鼻咽癌的 5 年生存率已高达 95%。但在临床实践中，由于鼻咽癌发病部位隐匿，发病症状与其他良性疾病难以鉴别，大部分鼻咽癌患者确诊时已处于中晚期，伴随颈部淋巴结和或远处转移，转移和复发风险显著升高，死亡率急剧上升。因此，提高鼻咽癌的早期诊断和预后判断水平是提升鼻咽癌整体治疗水平的有效途径。鼻咽癌标志物的开发、应用、评价和完善是实现上述目标的关键步骤。

国内首个《鼻咽癌标志物临床应用专家共识》指出：血浆EBV DNA筛查可以显著提高鼻咽癌的早诊率，从而相应地提高疗效，在鼻咽癌高发区，推荐将EBV DNA检测作为鼻咽癌早期筛查的常规项目；治疗前后血浆EBV DNA水平的变化可用于鼻咽癌疗效判断的依据；综合考虑治疗全程的血浆EBV DNA水平和TNM分期，可更加准确地判断预后，为肿瘤治疗后进展提供早期干预依据。

实时荧光定量PCR技术是目前EBV DNA检测应用最广泛的技术。由于可以实现快速、灵敏检测，大量文献证实荧光定量PCR检测 EBV-DNA 对鼻咽癌的诊断、治疗方案的选择、疗效判定及预后意义重大。但由于不同实验室PCR平台间缺少统一的检测执行标准，无论是样本类型、DNA提取方法、检测的DNA 片段、质量控制、检测设备、检测极限值等均缺乏统一标准，导致同一份样本在不同的实验室的检测结果，尤其在 EBV DNA 阈值设置上，存在较大差异，导致出现实验结果无法重复，甚至结果互相矛盾的状况。且依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。而检测报告结果的准确性直接影响临床疾病的诊断和治疗效果的判断，因此亟需研制更加敏感和精确的血浆EBV DNA定量方法和试剂，制定标准化的检测和结果判定方法，以提高 EBV DNA 检测临床应用的可靠性。

数字PCR (digital PCR)是近年来新出现的技术，通过对样本进行微小单元化处理，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且数字PCR不依靠任何校准物或外标便可直接计数目标分子数，为绝对定量PCR技术。因此数字PCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

发明内容

本申请的目的是为克服现有技术的不足，提供一种有效提高EB病毒检测灵敏度和准确度的基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒。